用于检测番茄灰叶斑病原菌的引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测番茄灰叶斑病原菌的引物及试剂盒。

背景技术：

番茄(solanumesculentuml.)是我国最主要的蔬菜之一，深受种植者和消费者喜爱，种植面积不断扩大，现已可以周年种植。制约番茄生产的因素除市场行情较难预测外，最主要的就是病虫多、危害较重。其中，番茄灰叶斑病(tomatograyleafspotdisease，glsd)是世界性病害。近年来，番茄灰叶斑病呈现出暴发流行更为严重的趋势，误诊或防治不及时，常造成番茄减产，一般减产20％左右，有的甚至减产80％以上，给种植户造成严重的经济损失(曹守军等，2011；刘国华，2012)。

番茄灰叶斑病由半知菌亚门匍柄霉属(stemphylium)真菌引起(al-mughrabi，2003)，主要通过种子传播，病菌可在保护地土壤中的病残体及种子上越冬，翌年温湿度适宜时产生分生孢子，进行初侵染，孢子通过风雨传播，进行再侵染。番茄灰叶斑病对番茄有致命的危害，因为即使在正常温度和湿度条件下，造成这种病害的病原物传播很快，它每周可完成两个孢子循环。该病主要为害叶片，发病初期在叶片上产生圆形或不规则形的灰褐色斑点，然后病斑沿着叶脉逐渐扩展呈不规则形，对番茄花、茎、果及新叶造成生长缓慢，植株萎蔫，轻者产量、品质降低，重者造成绝收(陈随菊，2011；杜白海和张建英，2013)。

番茄灰叶斑病在世界范围内均有发生，温暖潮湿地区发生严重，主要分布在美国、意大利、澳大利亚、以色列、加拿大、英国、毛里求斯、塞内加尔、赞比亚、安哥拉、尼日利亚、塞舌尔群岛、泰国、日本、巴西、印度、委内瑞拉、利比亚、苏丹、佛罗里达、马来西亚等地(atherton&rudich，1989；rotemetal.,1966)。近年来，该病在中国台湾、北京、辽宁、河北、重庆、贵州、海南、山东、浙江温州、嘉善、余杭、海宁、杭州等地均有发生，严重影响番茄生产，并在逐步扩延和加剧。因此，加强番茄灰叶斑病菌的防治对于保证番茄稳产、高产有着重要的作用。建立高效、快速、准确的病菌检测技术，这些可对制定正确的抗病育种策略和合理布局品种都具有极其重要的参考价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测番茄灰叶斑病原菌的引物，特异性强，检测准确性高，对于农业生产中番茄灰叶斑病原菌引起的病害防治具有重要的实用价值。

本发明还提供了一种包含上述引物的试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于检测番茄灰叶斑病原菌的引物，包括上游引物和下游引物，具体序列如下：

上游引物：5’-ctgaacccaccgcttttgccatgtc-3’；

下游引物：5’-cgaacatgggagcgtcggcggaa-3’。

上述引物特异性强，检测准确性高，适用于番茄灰叶斑病原菌pcr检测。用上述引物对待测样品进行pcr扩增，扩增产物有489bp大小的条带，则样品中含有番茄灰叶斑病原菌。

一种用于检测番茄灰叶斑病原菌的试剂盒，该试剂盒包括盒体和4支pcr管，在2支pcr管中分别装有2×taqpcrmastermix和ddh2o；在另外2支pcr管中分别装有用于检测番茄灰叶斑病原菌的上游引物及用于检测番茄灰叶斑病原菌的下游引物。

作为优选，用于检测番茄灰叶斑病原菌的上游引物序列为：5’-ctgaacccaccgcttttgccatgtc-3’；用于检测番茄灰叶斑病原菌的下游引物序列为：5’-cgaacatgggagcgtcggcggaa-3’。

本发明的有益效果是：适用于植物组织中番茄灰叶斑病原菌的快速检测，引物特异性强，检测准确性高，对于农业生产中番茄灰叶斑病原菌引起的病害防治具有重要的实用价值。

附图说明

图1为本发明引物特异性检测样品dna扩增后的凝胶电泳图。

图2为本发明田间病株上分离菌株dna扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明的引物由上海生物技术有限公司合成，所有序列测定工作均由上海生物技术有限公司完成。

实施例1：

根据genbank中三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gpd)的保守序列(genbank编号kf921502.1、ku599919.1、kc796690.1、ay278821.1、dq000654.1、af081398.1、af443883.1、af443886.1、kf479194.1)，设计引物stem-f与stem-r，扩增长度为489bp，对其片段进行克隆、测序和分析。番茄灰叶斑病原菌特异性的引物序列如下：

上游引物(stem-f)：5’-ctgaacccaccgcttttgccatgtc-3’(序列表中seqidno：1)；

下游引物(stem-r)：5’-cgaacatgggagcgtcggcggaa-3’(序列表中seqidno：2)。

序列表中的seqidno：1由25个碱基组成，seqidno：2由23个碱基组成，扩增片段长度为489bp。

实施例2：

一种用于检测番茄灰叶斑病原菌的试剂盒，该试剂盒包括盒体和4支pcr管，在2支pcr管中分别装有2×taqpcrmastermix和ddh2o；在另外2支pcr管中分别装有用于检测番茄灰叶斑病原菌的上游引物及用于检测番茄灰叶斑病原菌的下游引物。

用本发明的引物对番茄灰叶斑病原菌进行常规pcr检测

本例所述菌株：由浙江省农科院植微所提供的番茄灰叶斑病原菌。

检测方法按以下步骤进行：

1、菌丝dna的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0ml离心管中，按常规ctab法提取dna后，分别保存，备用；

2、pcr扩增：在各pcr管中分别加入步骤1提取的各样品dna1μl后，再依次加入2×taqpcrmastermix5μl(市售，天根生化)，上下游引物各0.25μl(终浓度0.25μm)，加ddh2o至10μl后，按pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃50seconds，58℃退火45seconds，72℃50seconds，35个循环进行扩增，72℃延伸10min，产物4℃保存；上游引物序列为seqidno：1，下游引物序列为seqidno：2。

3、pcr扩增产物的凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物10μl和由0.25％溴酚兰加40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μl，混匀，将混合物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经eb染色后用凝胶成像系统进行观察、照相。

4、番茄灰叶斑病原菌的检测：根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图1)：番茄灰叶斑病原菌扩增出489bp条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于番茄灰叶斑病原菌的常规pcr检测。

用本发明的引物对从番茄灰叶斑病株上分离的菌株进行常规pcr检测

本例所述菌株：由浙江番茄主栽区番茄灰叶斑病株上分离获得的菌株。

检测方法按以下步骤进行：

1、菌丝dna的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0ml离心管中，按常规ctab法提取dna后，分别保存，备用；

2、pcr扩增：在各pcr管中分别加入步骤(1)提取的各样品dna1μl后，再依次加入2×taqpcrmastermix5μl，上下游引物各0.25μl，加ddh2o至10μl后，按pcr反应程序：94℃预变性3min，94℃50seconds，58℃退火45seconds，72℃50seconds，35个循环进行扩增，72℃延伸10min，产物4℃保存；上游引物序列为seqidno：1，下游引物序列为seqidno：2。

3、pcr扩增产物的凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物10μl和由0.25％溴酚兰加40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μl，混匀，将混合物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经eb染色后用凝胶成像系统进行观察、照相。

4、番茄灰叶斑病原菌的检测：根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图2)：番茄灰叶斑病原菌扩增出489bp条带，表明本发明的引物可用于番茄灰叶斑病原菌的常规pcr检测。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

sequencelisting

<110>浙江省农业科学院

<120>用于检测番茄灰叶斑病原菌的引物及试剂盒

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