一种用于检测甲型副伤寒沙门氏菌的靶基因、特异性引物对及检测方法和试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学及生物检测技术领域，涉及一种用于检测甲型副伤寒沙门氏菌的靶基因、特异性引物对及检测方法和试剂盒。

背景技术：

甲型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphia)是引起人类感染的主要沙门氏菌血清型之一，此血清型菌株的主要宿主为人类。这是一种消化道传染病，潜伏期为8至10天，被感染者起病急，先有恶心，呕吐，2-3天后发热等伤寒症状并伴有不同程度的其他病症。在最近的研究报告中显示，甲型副伤寒沙门氏菌会通过某些食物经口腔侵染到健康人体，从而引起以上各方面的症状。弓耀忠、赵海霞在2007年s2期的《一株甲型副伤寒沙门氏菌的启示》讲述，通过一株甲型副伤寒沙门氏菌的检测验证，提示检验人员在具体检验过程中，在遵循一般规律的同时，要考虑特殊菌株的生化特异性，多参考国内外最新资料，不能机械、一味地按gb/t4789.4-2003程序检验，易导致漏检或误判。国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定沙门氏菌为必检项目。目前，甲型副伤寒沙门氏菌检测主要使用传统的培养方法，整个检测过程步骤较多，时间较长，一般需要4-6个工作日，而且干扰的因素较多，检测结果的判定较复杂，给食品检测带来非常不利的影响。

目前，随着分子生物学的不断发展尤其是聚合酶链式反应(pcr)的发展，通过分子技术检测鉴定沙门氏菌血清型变得更加可靠。用于甲型副伤寒沙门氏菌的pcr检测的靶基因研究较少且主要是依赖于国外学者的研究，如gracejieyinngan等在《researchinmicrobiology》2010年161期243-248页发表的题为《developmentofanovelmμltiplexpcrforthedetectionanddifferentiationofsalmonellaentericaserovarstyphiandparatyphia》中所述，其中sspa1723a和sspa1724a是甲型副伤寒沙门氏菌检测的靶标基因。但通过进一步分析，以上基因同时存在鼠伤寒沙门氏菌，由此证明以其作为甲型副伤寒沙门氏菌的检测靶点很可能出现假阳性的现象，以上述基因作为靶基因，会造成检测结果不准确。

技术实现要素：

针对现有技术不足，本发明提供一种用于检测甲型副伤寒沙门氏菌的靶基因、特异性引物对及检测方法和试剂盒，解决了现有技术中甲型副伤寒沙门氏菌结果不准确、检测结果判定复杂、检测周期长的技术问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种用于检测甲型副伤寒沙门氏菌的靶基因，gene3270、gene3268、gene3106，gene3270具有如seqidno.1所示的核苷酸序列或其特异性片段，gene3268具有如seqidno.2所示的核苷酸序列或其特异性片段，gene3106具有如seqidno.3所示的核苷酸序列或其特异性片段。

用于扩增所述靶基因的特异性引物对，所述特异性引物对分别为：pa2、pa5、pa7，其中，

pa2-f：核苷酸序列如seqidno.5所示、pa2-r：核苷酸序列如seqidno.6所示；

pa5-f：核苷酸序列如seqidno.7所示、pa5-r：核苷酸序列如seqidno.8所示；

pa7-f：核苷酸序列如seqidno.9所示、pa7-r：核苷酸序列如seqidno.10所示。

一种检测甲型副伤寒沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

s1、提取样品dna，pcr扩增；

s2、凝胶电泳检测扩增产物；

s3、比较电泳后条带，若在574bp、146bp和191bp位置有条带，则样品中含有甲型副伤寒沙门氏菌。

优选的，所述凝胶电泳后574bp位置分离出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.1所示；146bp位置分离出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.2所示；191bp位置分离出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

优选的，所述pcr扩增过程中，25μl包含有2×master12.5μl，10μm引物对1μl，模板取1-5μl，补ddh2o至25μl。

优选的，所述pcr扩增过程的反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。

优选的，所述凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。

优选的，以25μlpcr反应体系计量，对于权利要求2所述的pa2、pa5和pa7引物，需要甲型副伤寒沙门氏菌总dna浓度≥4.837pg/μl。

一种用于检测甲型副伤寒沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物对。

一种所述的靶基因或所述的特异性引物对或所述的试剂盒在检测甲型副伤寒沙门氏菌中的应用。

本发明提供一种用于检测甲型副伤寒沙门氏菌的靶基因、特异性引物对及检测方法和试剂盒，与现有技术相比优点在于：

本发明通过基因组比较分析获得甲型副伤寒沙门氏菌的特异性检测靶基因，从而通过特异性引物对进行pcr扩增、电泳检测该目的基因，本发明检测结果准确，检测过程简单，检测周期短，实现了甲型副伤寒沙门氏菌高特异性快速检测的目的；

本发明提供检测甲型副伤寒沙门氏菌的3个特异性靶基因、相应的pcr引物对、利用以上引物对和靶基因进行检测，特异性引物对是根据3个甲型副伤寒沙门氏菌特异性检测靶点设计而成，该特异性检测靶点稳定高、特异性强，通过合理优化pcr扩增反应体系，凝胶电泳检测手段，可以快速、准确地鉴定出甲型副伤寒沙门氏菌；

采用本发明的检测方法可直接鉴定甲型副伤寒沙门氏菌，不需要血清型实验，检测时间缩短在12h以内，并且，由于检测过程无需采用传统检测方法中必须使用的抗血清，可降低检测成本，本发明通过pcr检测特异性dna片段，具有单一性强，检测结果可靠，结果判定简单的特点，能够广泛应用于食品卫生领域。

附图说明

图1为本发明特异性引物对pa2、pa5和pa7对不同菌种特异性评价凝胶电泳结果图；

图2为本发明特异性引物对pa2、pa5和pa7对不同模板浓度灵敏度评价凝胶电泳结果图。

图中a为pa2特异性引物对；b为pa5特异性引物对；c为pa7特异性引物对；2a为pa2特异性引物对；2b为pa5特异性引物对；2c为pa7特异性引物对；

1、甲型副伤寒沙门氏菌；2、无菌水；3、猪霍乱沙门氏菌；4、乙型副伤寒沙门氏菌；5、丙型副伤寒沙门氏菌；6、汤普逊沙门氏菌；7、亚利桑那沙门氏菌；8、都柏林沙门氏菌；9、鸭沙门氏菌；10、波斯坦沙门氏菌；11、阿伯丁沙门氏菌；12、病牛沙门氏菌；13、山夫顿堡沙门氏菌；14、火鸡沙门氏菌；15、德比沙门氏菌；16、伦敦沙门氏菌；17、鼠伤寒沙门氏菌；18、鼠伤寒沙门氏菌；19、肠炎沙门氏菌；20、布雷德沙门氏菌；21、达喀尔沙门氏菌；22、伊斯特本沙门氏菌；23、迈阿密沙门氏菌；24、肠炎沙门氏菌；25、阿贡纳沙门氏菌；26、巴森海德沙门氏菌；27、蒙特维的亚沙门氏菌；28、耶路撒冷沙门氏菌；29、波恩沙门氏菌；30、布伦登鲁普沙门氏菌；31、圣保罗沙门氏菌；32、海德尔堡沙门氏菌；33、肯塔基沙门氏菌；34、布洛克利沙门氏菌；35、博纳恩沙门氏菌；36、旺兹沃斯沙门氏菌；37、阿德莱德沙门氏菌；38、无菌水。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

pcr检测方法对不同菌种特异性评价

1、甲型副伤寒沙门氏菌血清型特异性基因的筛选

在ncbi数据库中获得了甲型副伤寒沙门氏菌cmcc50973菌株(nz_cp009049.1)的全基因组序列，根据比较基因组的方法将该菌基因组的每个基因利用ncba网站的blast程序进行比对，选择与该血清型同源性较高(e值＝0,qμerycover＝0％)同时与其它微生物的同源性很低(qμerycover＜10％)的基因作为甲型副伤寒沙门氏菌的准特异性基因。通过该方法共获得7个甲型副伤寒沙门氏菌的准特异性基因，再针对每一个基因设计多对引物，利用实验室保存的沙门氏菌其它血清型进行特异性验证。根据pcr结果，确定gene3270、gene3268和gene3106基因作为甲型副伤寒沙门氏菌血清型特异性的检测靶点，基因序列分别如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示。

2、引物设计

通过primer5.0软件设计引物，设置gc％范围在40-60％，产物大小范围为100-600bp，从备选引物对中选择出引物，3对特异性引物对：pa2、pa5和pa7，核苷酸序列分别为pa2-f：seqidno.5、pa2-r：seqidno.6；pa5-f：seqidno.7、pa5-r：seqidno.8；pa7-f：seqidno.9、pa7-r：seqidno.10；委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3、dna模板的制备

将包括甲型副伤寒沙门氏菌(s.paratyphia)等46株沙门氏菌标准菌株和18株非沙门氏菌(如表1)(编号为cicc的菌株购自于中国工业微生物菌种保藏中心，编号为cmcc的菌株购自于中国医学微生物菌种保藏中心，无编号的为实验室自己保藏的菌株，如果其他同行出于研究需要，本试验室愿意提供该菌株)的各个血清型分别接种到30ml的lb液体培养基中，37℃培养8h。分别取1ml各菌菌悬液于1.5ml离心管中，12000r/min，离心1min，弃上清。用500μl灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用100μl灭菌纯水溶解沉淀。在沸水浴中煮沸10min，12000r/min，离心1min，取上清液作为pcr模板。

4、pcr扩增反应体系的建立

建立pcr检测体系：25μl反应体系包含：2×master12.5μl，10μm引物对1μl，模板取1μl，补ddh2o至25μl。

设定pcr的反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。于pcr仪中按照既定的反应体系和反应程序分别以上述步骤中提取的各菌菌株dna为模板进行pcr扩增，以做凝胶电泳进行检测。

5、凝胶电泳检测

将上述进行pcr扩增后的产物和作为marker的ds2000按照既定的顺序分别取6μl加到1％的琼脂糖凝胶中，用150v电压跑40min后，goldview染色后观察结果。

pcr凝胶检测结果如图1、表1和表2，以包括甲型副伤寒沙门氏菌(s.paratyphia)在内的37株沙门氏菌dna作为模板，pcr扩增后仅有甲型副伤寒沙门氏菌在574bp、191bp和146bp出现特异性电泳条带；为更好说明本发明的特异性，以不同来源的沙门氏菌共46株和18株非沙门氏菌(表1和表2中，其中“*”代表分离株，其它为标准菌株)进行pcr扩增，凝胶电泳得到结果如表1所述。电泳结果在574bp、191bp和146bp位置出现扩增条带时，证明为阳性结果，以“+”表示；当该位置没有扩增条带，证明为阴性结果，以“-”表示；从表1也可以看出，经过该方法pcr扩增，仅甲型副伤寒沙门氏菌(s.paratyphia)出现阳性反应。结果很好地说明了本发明提供的方法稳定性高，特异性强，适用范围广，检测结果准确。

实施例2：

pcr检测方法对不同模板浓度灵敏度评价

甲型副伤寒沙门氏菌血清型特异性基因的筛选、引物设计步骤如实施例1。

dna模板的制备：挑取甲型副伤寒沙门氏菌单菌落转接到30ml的lb液体培养基中，37℃过夜培养。以上海生工生物工程技术服务有限公司生产的细菌基因组dna小量提取试剂盒，提取甲型副伤寒沙门氏菌总dna，经测定，浓度为48.37ng/μl。用无菌水作10倍梯度稀释，共稀释7个梯度，作为pcr模板。

pcr扩增反应体系的建立：建立pcr检测体系：25μl反应体系包含：2×master12.5μl，10μm引物对1μl，模板取5μl，补ddh2o至25μl。设计pcr的反应程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。

取上述步骤中6个梯度dna模板各取1μl加入pcr反应体系，于pcr仪上进行反应扩增。取6μlpcr扩增产物到1％的琼脂糖凝胶中，用150v电压跑40min后，goldview染色后观察结果。

针对于pa2、pa5和pa7引物对从第1到第5泳道574bp、146bp和191bp处均有条带显示，第5泳道相应的浓度为4.837pg/μl，电泳结果如图2中的2a、2b和2c(图2中m为dl2000；模板浓度1-6为48.37ng/μl、4.837ng/μl、483.7pg/μl、48.37pg/μl、4.837pg/μl和483.7fg/μl)所示。因此，判定对于pa2、pa5和pa7引物的pcr检测灵敏度为4.837pg/μl。

表1特异性评价所用的菌株及检测结果

表2特异性评价所用的菌株及检测结果

综上所述，本发明通过基因组比较分析获得甲型副伤寒沙门氏菌的特异性检测靶基因，从而通过特异性引物对进行pcr扩增、电泳检测该目的基因，本发明检测结果准确，检测过程简单，检测周期短，实现了甲型副伤寒沙门氏菌高特异性快速检测的目的；

本发明提供检测甲型副伤寒沙门氏菌的3个特异性靶基因、相应的pcr引物对、利用以上引物对和靶基因进行检测，特异性引物对是根据3个甲型副伤寒沙门氏菌特异性检测靶点设计而成，该特异性检测靶点稳定高、特异性强，通过合理优化pcr扩增反应体系，凝胶电泳检测手段，可以快速、准确地鉴定出甲型副伤寒沙门氏菌；

采用本发明的检测方法可直接鉴定甲型副伤寒沙门氏菌，不需要血清型实验，检测时间缩短在12h以内，并且，由于检测过程无需采用传统检测方法中必须使用的抗血清，可降低检测成本，本发明通过pcr检测特异性dna片段，具有单一性强，检测结果可靠，结果判定简单的特点。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。