一种全血直接实时荧光PCR的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用一种抗干扰液抑制血红素对实时荧光pcr（real-timepcr）仪信号采集的干扰，可利用预混抗干扰液的全血为模板直接进行real-timepcr扩增。

背景技术：

无论临床实验室检测还是疫情处理，传染病病原还是转基因动物分型，血液的real-timepcr扩增均需经过核酸提取或纯化过程。目前常用的酚氯仿抽提法通常需要消耗数个小时，其它提取dna的试剂盒也常常需要1-2个小时，并且dna提取过程也会增加模板污染或损失的风险。因此，实验人员急需一种操作简便、结果准确的real-timepcr方法。

b.mercier等人在1990年探究了利用全血进行直接pcr（direct-pcr）的方法，通过增加一步对全血的预处理步骤，并更换pcrbuffer的成分，从而达到有效的扩增目的基因的目的；1994年j.burckhardt等人利用90℃1min-50℃1min（循环20次）的预处理方法使白细胞裂解来进行血液的direct-pcr，此方法还依据血液中抗凝剂的种类来优化kcl和mgcl2的浓度，以达到扩增最优效果；后续有学者通过洗去红细胞，收集白细胞直接进行扩增，或加热收集的细胞后进行pcr扩增。由于血液中的血红素卟啉环在415～430nm的位置上存在着分子吸光，会对real-timepcr仪的信号采集产生强烈的干扰，因此上述direct-pcr方法只适合于用琼脂糖凝胶电泳进行结果验证的普通pcr，不适合real-timepcr。因此，需要研究一种试剂可以抑制血红素的干扰，从而提供一种操作简便的全血直接real-timepcr的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种无需提取血液dna的全血直接real-timepcr方法，此方法可以同时处理大量血液样品，实现高通量的以real-timepcr扩增为基础的分子操作，快速，简便，节省成本，降低模板污染风险。此外，该方法尤其适合少量采血（例如2μl）的标本检测，节省样本。

为解决上述技术问题，本发明采用下述优化的技术方案。

1）取2μl普通干燥管、肝素抗凝管或edta抗凝管收集的全血。

2）加双蒸水50μl破裂红细胞，3500rpm离心5min，弃上清。

3）加入总体积为20μl的抗干扰液，混合2min。

4）取5μl混合液进行real-timepcr实验。

所述的抗干扰液的成份含10mmtris-hcl，0.2mmna2edta，0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)异硫氰酸烯丙酯，ph8.6。其中异硫氰酸烯丙酯0.04%-0.1%，优选为0.06%（图1）。

所述的real-timepcr体系缓冲液（10xpcrbuffer）含160mm(nh4)2so4，750mmtris-hcl，tween-200.1%，甘油50%，ph8.8。其中tris-hcl为10mm、50mm、75mm、100mm，优选为75mm（图2）。

所述的real-timepcr实验体系为25μl含0.5μlhstaq酶，3μl25mmmg²⁺，2μl2.5mmdntp，2.5μl10xpcrbuffer，0.5μl20μm上下游引物，0.25μl10μm探针，5μl模板，用双蒸水补足至25μl。

所述的real-timepcr的反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30sec，50℃-60℃复性30sec，72℃延伸30sec，40-50个循环，在退火阶段采集通道的荧光。熔解曲线设置为：95℃预变性15sec后从40℃开始，升温速率为0.4℃/步，在40℃至80℃范围内采集相应通道的荧光信号。

本发明提供的无需提取血液dna的全血直接real-timepcr方法，无同类产品可比，是本研究首创。该方法简单、快速并能够降低模板污染风险；该方法特别适用于少量采血（例如2μl）的标本检测，节省样本；该方法可实现高通量的以全血real-timepcr扩增为基础的分子操作如基因分型、微卫星分析、亲子鉴定、动物转基因鉴定、疫情处理、病原体分型方面的检测应用。

附图说明

图1、示出本发明抗干扰液处理血液的效果，其中a为血液稀释100倍的效果，b为2μl血液直接加18μl抗干扰液的结果。

图2、示出本发明干扰液中异硫氰酸烯丙酯浓度优化效果。

图3、示出本发明10xpcrbuffer中tris-hcl浓度优化效果。

图4、示出本发明snp检测实施案例结果，其中a为扩增曲线，b为溶解曲线，c为测序验证结果。

图5、示出本发明白血病融合基因检测实施案例结果，其中a为扩增曲线，b为测序验证结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明方法，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1。

血液中的血红素会干扰real-timepcr扩增时的信号采集，去除血红素干扰是real-timepcr扩增信号有效采集的基础。操作步骤如下。

配制抗干扰液：10mmtris-hcl，0.2mmna2edta,0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)异硫氰酸烯丙酯，ph8.6。

准备普通干燥管收集的血液10μl（未凝固）。

取2μl血液加入18μl抗干扰液，混匀2min。

取2μl血液加入200μl双蒸水，混匀2min。

加抗干扰液管内的血红素产生的红色褪去，而相同条件下用双蒸水稀释100倍的稀释液仍有淡红色（图3），实验结果说明本发明的抗干扰液可以抑制血红素产生的红色。

实施例2。

肝素抗凝管收集的全血样本snp检测（foxp2基因）。需要说明的是：血液中含有肝素时，可能抑制taqdna聚合酶的活性，也有可能因为肝素能结合并激活全血中多种蛋白酶原和补体系统，由此引起的一系列酶学效应使dna在提取过程中不断降解，导致pcr效率降低。本实施例的real-timepcr扩增效果未受肝素影响，且在33个循环时信号可以超过dna模板（edta抗凝血液纯化的dna）的扩增信号（图4）。

foxp2是第一个证实与语言障碍有关联的基因，有报道证实foxp2基因中的rs1456031位点（c/t）在中国人群与语言能力的具有一定的相关性。

本实施例设计上游引物foxp2-qf：5'-gaggtggctaagtgctcatc-3’；下游引物foxp2-qr：5'-cggtaacttattctgctatcctgt-3'；fam标记的探针foxp2-fam-p：

5'-ccatgtgtgattgcacgcctacaaacatgg-3'，3'端标记bhq1，用于检测rs1456031位点（c/t）。

配制抗干扰液：10mmtris-hcl，0.2mmna2edta,0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)异硫氰酸烯丙酯，ph8.6。

配制10xpcrbuffer：160mm(nh4)2so4，750mmtris-hcl，tween-200.1%，甘油50%，ph8.8。

配制real-timepcr体系：25μl含0.5μlhstaq酶，3μl25mmmg²⁺，2μl2.5mmdntp，2.5μl10xpcrbuffer，0.5μl20μm上下游引物，0.25μl10μm探针，5μl模板，用双蒸水补足至25μl。

real-timepcr的反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30sec，52℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环，在52℃退火阶段采集通道的荧光。熔解曲线设置为：95℃预变性15sec后从40℃开始，升温速率为0.4℃/步，在40℃至80℃范围内采集相应通道的荧光信号，实验结果为t/t纯合子，与测序结果一致（图4）。

实施例3。

edta抗凝管收集的全血白血病融合基因检测（pml-rara融合基因），大约95%的急性早幼粒细胞白血病（apl）病人带有pml-rara融合基因，它产生于染色体易位t(15;17)(q24;q21)，是15号染色体（涉及pml基因）和17号染色体（涉及rara基因）经过断裂和重组形成。pml-rara融合基因使rara靶基因的转录受到抑制，阻止髓性细胞的分化，使其停留在不成熟的早幼粒细胞阶段。联合应用全反式维甲酸（atra）和三氧化二砷（as2o3）的治疗方案，可以诱导含pml-rara的apl细胞恢复分化能力，使apl得到治愈。在病人经过治疗达到缓解后，还可通过定量分析pml-rara的表达水平来预测复发风险高低。因此，检测pml-rara将有助于apl病人的诊断、靶向治疗方案的确立、预后判断和复发风险的预测。

设计上游引物pml-f3：5'-gcttcgacgagttcaaggtg-3'，pml-f7：5'-aggtcttcctgcccaaca-3'。下游引物rara-r2：5'-cttgtagatgcggggtaga-3'。fam标记探针p/r-fam-p：5'-tgaagagatagtgcccagccctc-3'，3'端标记bhq1。

用edta抗凝管收集白血病阳性病人血液（测序结果为pml-rara基因融合s型，北京医院）。

配制抗干扰液：10mmtris-hcl，0.2mmna2edta，0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)异硫氰酸烯丙酯，ph8.6。

配制10xpcrbuffer：160mm(nh4)2so4，750mmtris-hcl，tween-200.1%，甘油50%，ph8.8。

配制real-timepcr体系：25μl含0.5μlhstaq酶，3μl25mmmg²⁺，2μl2.5mmdntp，2.5μl10xpcrbuffer，0.5μl20μm上下游引物（上游引物两条），0.25μl10μm探针，5μl模板，用双蒸水补足至25μl。

real-timepcr的反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec，50个循环，在60℃退火阶段采集通道的荧光。实验结果为阳性，与测序结果一致（图5，pml-rara基因融合s型）。本实施例中对照gusb基因是一种管家基因，其上游引物gus-tag-f2:5'-gaaaatacgtggttggagagctcatt-3'，下游引物gus-tag-r2:5'-gccgagtgaagatccccttttta-3'，探针为rox修饰5'-cagcactctcgtcggtgact-3'，3'端标记bhq1。

显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。