本发明涉及一类氧杂蒽酮荧光染料及其在制备活细胞染料与亚细胞器染料的应用。
二、技术背景
荧光探针由于具有非侵入性、易操作、能够实现可视化检测等特点，近年来，受到普遍关注。目前，随着荧光成像和检测手段的进步，应用荧光探针对细胞内蛋白的分布及其功能进行研究已成为生命科学研究的非常重要手段之一，倍受生物化学、药物化学、酶组学等多个领域科研工作者的关注。
荧光染料在荧光技术的开发应用中起着关键性作用，激光共聚焦荧光成像技术和超分辨荧光技术的发展，都依赖于相应的荧光染料的发展。目前已被广泛应用的几大类荧光染料包括荧光素、四乙基罗丹明、四甲基罗丹明等，其具有优良的荧光量子产率、光谱稳定性、细胞毒性小等优点。但是它们的斯托克斯位移不够大，在细胞成像研究过程中，容易产生严重的背景干扰。
在众多荧光染料中，具有氧杂蒽酮结构的荧光素染料，由于具有不错的摩尔消光系数和荧光量子产率、光谱性质稳定、光热及化学稳定性好、分子量小、细胞毒性小等优点，作为生物分子荧光探针和荧光成像试剂备受关注。但由于其激发和发射波长都比较短，在进行活细胞成像研究时，组织透过性差。
因此，开发在斯托克斯位移、激发波长和发射波长、光稳定性、细胞毒性诸多方面均性质优越的荧光染料具有重要的意义。
三、
技术实现要素：
本发明旨在以氧杂蒽酮为母核结构开发一种具有斯托克斯位移大于100nm和荧光波长大于550nm的荧光染料，并且可用于活细胞染色和亚细胞器定位成像和微环境检测。
本发明的技术目通过以下方案实现：
一类氧杂蒽酮荧光染料，具有如下结构通式iii、iv：
r1、r2、r3、r4分别选自氢、卤素、羟基、nh2、巯基、氰基、硝基、n，n-双c1-4烷基氨基、醛基、羧基、酰胺基、磺酰胺基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、c1-6烷基、硼酸、硼酸频哪醇酯、or(其中r为c1-4的饱和烷基和不饱和烷基)。
本发明所涉及的氧杂蒽酮染料iii可用如下方法合成。首先在氯化铜催化下，苯酚衍生物和邻硝基苯甲醛衍生物反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后通过溴代、氧化获得目标化合物。
本发明所涉及的氧杂蒽酮染料iv可用如下方法合成。首先在氯化铜催化下，苯酚衍生物和对甲基邻硝基苯甲醛反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后通过溴代、氧化、witting反应，获得目标化合物。
本发明所述氧杂蒽酮类荧光染料具有如下显著特征：
1.荧光强度和荧光量子产率与溶剂呈现良好线性关系；
2.荧光波长较长，斯托克斯位移大于100nm；
3.在非质子溶剂中荧光较强，波长较短，在质子溶剂中荧光较弱，波长较长
4.合成简便，产品易得；
5.鉴于本发明荧光染料的上述特征，进一步提供其在制备活细胞荧光染料、尤其是在活细胞亚细胞器定位染料中的应用。
四、附图说明
附图1为化合物(e)-3-(4-methylstyryl)-9h-xanthen-9-one的紫外和荧光光谱随溶剂极性变化图。
附图2为化合物(e)-3-(4-chlorostyryl)-9h-xanthen-9-one的紫外和荧光光谱随溶剂极性变化图。
附图3为化合物(e)-3-(3，4-dimethoxystyryl)-9h-xanthen-9-one的紫外和荧光光谱随溶剂极性变化图。
附图4为化合物(e)-3-(3，4，5-trimethoxystyryl)-9h-xanthen-9-one的紫外和荧光光谱随溶剂极性变化图。
附图5为a.ct26细胞和ii-3培养2h；b.hmsc细胞和ii-3培养2h。第一列351nm激发，第二列457nm激发，第三列514nm激发，第四列transmission，第五列各通道叠加信号图像。
附图6为a.huvec细胞和i-7染料培养2h；b.hmsc细胞和i-7染料培养2h。第一列351nm激发，第二列457nm激发，第三列514nm激发，第四列transmission，第五列各通道叠加信号图像。
五、具体实施方案
1.本发明提供一类具有结构通式iii、iv的氧杂蒽酮荧光染料。
r1、r2、r3、r4分别选自氢、卤素、羟基、nh2、巯基、氰基、硝基、n，n-双c1-4烷基氨基、醛基、羧基、酰胺基、磺酰胺基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、c1-6烷基、硼酸、硼酸频哪醇酯、or(其中r为c1-4的饱和烷基和不饱和烷基)；
具体实施方式之一，所述r1分别选自氢、卤素、oh、nh2、n，n-双c1-4烷基氨基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、c1-6烷基，硼酸、硼酸频哪醇酯、or(其中r为c1-4的饱和烷基和不饱和烷基)。
另一具体实施方式，所述r2分别选自氢、卤素、oh、nh2、n，n-双c1-4烷基氨基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、c1-6烷基，硼酸、硼酸频哪醇酯、or(其中r为c1-4的饱和烷基和不饱和烷基。
再一具体实施方式，r3、r4分别选自oh、sh、no2、nh2、n，n-双c1-4烷基氨基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、c1-6烷基，硼酸、硼酸频哪醇酯、or(其中r为c1-4的饱和烷基和不饱和烷基。
更为具体地，本发明所述的氧杂蒽酮染料，选自如下结构的化合物：
本发明进一步提供所述i荧光染料的制备方法，包括以下步骤：苯酚衍生物和邻硝基苯甲醛衍生物，在氯化铜催化下反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后氧化的醛基，所得醛再与witting盐发生成双键反应，获得目标化合物。
本发明更进一步提供所述ii荧光染料的制备方法，包括以下步骤：苯酚衍生物和邻硝基苯甲醛衍生物，在氯化铜催化下反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后氧化的二醛化合物，所得醛再与witting盐发生成双键反应，获得目标化合物。
本发明所涉及的氧杂蒽酮染料iii可用如下方法合成。首先在氯化铜催化下，苯酚衍生物和邻硝基苯甲醛衍生物反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后通过溴代、氧化获得目标化合物。
本发明所涉及的氧杂蒽酮染料iv可用如下方法合成。首先在氯化铜催化下，苯酚衍生物和对甲基邻硝基苯甲醛反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后通过溴代、氧化、witting反应，获得目标化合物。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单制备得到。
应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有一些可在上述步骤进行之前或刚完成后，通过标准的芳香族取代反应来引入或者通过常规官能团修饰来产生，这包括在本发明的方法步骤方面。这种反应和修饰包括例如取代基通过芳族取代反应引入，取代基还原，取代基的烷基化和取代基的氧化。芳香族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，feiedelcrafts条件引入酰基、烷基。修饰的具体实例包括通过例如镍催化、亚铁盐对硝基的还原；将巯基氧化成亚磺酰基、磺酰基。
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本发明中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如“c1-6烷基”包括甲基、乙基、正丙基、正丁基和叔丁基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本发明所述氧杂蒽酮荧光染料的荧光性质对环境敏感，可用于活细胞特异细胞器定位染色。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。
具体实施方式：
实施例1
(e)-3-(4-(dimethylamino)styryl)-9h-xanthen-9-one
化合物(e)-3-(4-(dimethylamino)styryl)-9h-xanthen-9-one的制备
邻硝基苯甲醛(20.0g，0.13mol)、间甲基苯酚(18.6g，0.17mol)、无水氯化铜(890mg，6.6mmol)、三苯基膦(2.6g，10mmol)与无水磷酸钾(62.0g，0.29mol)溶解到100毫升重蒸甲苯中，反应液在110℃条件下回流；反应24小时后反应液冷却到室温，将用硅藻土过滤，并用乙酸乙酯多次清洗滤饼；然后经减压蒸馏将溶剂蒸干。残留物用150毫升乙酸乙酯溶解后，加等量水洗多次，直至水相颜色有深棕色变为澄清；后用40％氢氧化钠水溶液洗多次，直至水相由深棕色变为澄清；最后，饱和食盐水洗3到5次；有机相用无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析分离，干法上样，石油醚比乙酸乙酯50比1；或重结晶，到乳白色粉末状固体或白色针状晶体a(20g，75％)。
中间体a(840mg，4mmol)，在过氧苯甲酰(96.0mg，0.4mmol)，nbs(720，4mmol)加到100毫升封管中，40毫升四氯化碳溶解，反应液在100℃油浴中搅拌反应，反应1个小时，停止加热，冷却到室温，硅藻土过滤，滤液减压蒸馏，残留物用40毫升氯仿溶解，加入1.4克tbadc，回流反应4个小时。然后将反应液冷却到室温，硅藻土过滤未反应tbadc，滤液减压蒸馏，残留物加入40毫升乙酸乙酯溶解，再加等量水洗3到5次，最后用40毫升饱和氯化钠水溶液洗3次，无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏；柱层析分离，干法上样，石油醚比乙酸乙酯5比1。得中间体c(430mg，48％)。
上述反应得到的化合物c(224mg，0.1mmol)和d(434mg，0.1mmol)，与1.2个当量的乙醇钠加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黄色粉末状目标化合物273毫克，收率63％。
实施例2：
(e)-3-(4-hydroxystyryl)-9h-xanthen-9-one
化合物(e)-3-(4-hydroxystyryl)-9h-xanthen-9-one的制备
按照实施例1，制备化合物c。化合物c(224mg，0.1mmol)，对羟基苄基三苯基磷盐(434mg，0.1mmol)，乙醇钠(20.4mg，0.3mmol)加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黄色粉末状目标化合物240毫克，收率76％。1hnmr(400mhz，dmso)δ9.81(s，1h)，8.23-8.18(m，j＝7.8，1.3hz，1h)，8.14(d，j＝8.2hz，1h)，7.88(t，j＝7.8hz，1h)，7.76(s，1h)，7.70(d，j＝8.4hz，1h)，7.66(d，j＝8.3hz，1h)，7.56-7.45(m，2h)，7.21(d，j＝16.4hz，1h)，6.83(d，j＝8.5hz，1h)。
实施例3：
(e)-3-(4-nitrostyryl)-9h-xanthen-9-one
化合物(e)-3-(4-nitrostyryl)-9h-xanthen-9-one的制备
按照实施例1，制备化合物c。化合物c(224mg，0.1mmol)，对硝基苄基三苯基磷盐(434mg，0.1mmol)，乙醇钠(20.4mg，0.3mmol)加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黄色粉末状目标化合物240毫克，收率76％。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.36-8.28(m，j＝7.9，1.1hz，1h)，8.22(d，j＝8.2hz，1h)，8.11(d，j＝8.7hz，2h)，7.75-7.68(m，1h)，7.45(d，j＝8.4hz，1h)，7.39(d，j＝8.4hz，3h)，7.32(s，1h)，7.19(d，j＝8.2hz，1h)，6.89(d，j＝12.3hz，1h)，6.82(d，j＝12.3hz，1h)。
实施例4：
(e)-3-(4-methoxystyryl)-9h-xanthen-9-one
化合物(e)-3-(4-methoxystyryl)-9h-xanthen-9-one的合成
按照实施例1，制备化合物c。化合物c(224mg，0.1mmol)，对甲氧基苄基三苯基磷盐(434mg，0.1mmol)，乙醇钠(20.4mg，0.3mmol)加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黄色粉末状目标化合物240毫克，收率76％。1hnmr(400mhz，dmso)δ8.19(d，j＝7.0hz，1h)，8.15(d，j＝8.3hz，1h)，7.88(t，j＝7.2hz，0h)，7.78(s，0h)，7.74-7.60(m，1h)，7.56(d，j＝16.4hz，0h)，7.48(t，j＝7.4hz，oh)，7.28(d，j＝16.4hz，0h)，7.00(d，j＝8.5hz，1h)，2.51(s，1h)。
实施例5
(e)-3-(4-(4，4，5，5-tetramethyl-1，3，2-dioxaborolan-2-yl)styryl)-9h-xanthen-9-one
邻硝基苯甲醛(20.0g，0.13mol)、间甲基苯酚(18.6g，0.17mol)、无水氯化铜(890mg，6.6mmol)、三苯基膦(2.6g，10mmol)与无水磷酸钾(62.0g，0.29mol)溶解到100毫升重蒸甲苯中，反应液在110℃条件下回流；反应24小时后反应液冷却到室温，将用硅藻土过滤，并用乙酸乙酯多次清洗滤饼；然后经减压蒸馏将溶剂蒸干。残留物用150毫升乙酸乙酯溶解后，加等量水洗多次，直至水相颜色有深棕色变为澄清；后用40％氢氧化钠水溶液洗多次，直至水相由深棕色变为澄清；最后，饱和食盐水洗3到5次；有机相用无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析分离，干法上样，石油醚比乙酸乙酯50比1；或重结晶，到乳白色粉末状固体或白色针状晶体a(20g，75％)。
中间体a(840mg，4mmol)，在过氧苯甲酰(96.0mg，0.4mmol)，nbs(720，4mmol)加到100毫升封管中，40毫升四氯化碳溶解，反应液在100℃油浴中搅拌反应，反应1个小时，停止加热，冷却到室温，硅藻土过滤，滤液减压蒸馏，残留物用40毫升氯仿溶解，加入1.4克tbadc，回流反应4个小时。然后将反应液冷却到室温，硅藻土过滤未反应tbadc，滤液减压蒸馏，残留物加入40毫升乙酸乙酯溶解，再加等量水洗3到5次，最后用40毫升饱和氯化钠水溶液洗3次，无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏；柱层析分离，干法上样，石油醚比乙酸乙酯5比1。得中间体c(430mg，48％)。
上述反应得到的化合物c(224mg，0.1mmol)和d(434mg，0.1mmol)，与1.2个当量的乙醇钠加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黄色粉末状目标化合物273毫克，收率63％。1hnmr(400mhz，dmso)δ7.70-7.79(m，5h)，7.43-7.46(m，2h)，7.14-7.42(m，4h)，6.90(d，j＝14hz，1h)，5.95(d，j＝14hz，1h)，1.20(s，12h)；13cnmr(100mhz，dmso)δ175.2，155.6，140.3，137.5，135.2，133.3，130.7，129.9，127.4，126.4，125.9，124.3，88.1，24.7。
实施例6：
(e)-1，3，3-trimethyl-2-(2-(9-oxo-9h-xanthen-3-yl)vinyl)-3h-indol-1-ium
化合物(e)-1，3，3-trimethyl-2-(2-(9-oxo-9h-xanthen-3-yl)vinyl)-3h-indol-1-ium的合成。按照实施例1，制备化合物c。化合物c(224mg，0.1mmol)，吲哚啉(174mg，0.1mmol)，乙醇钠(20.4mg，0.3mmol)加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黑色粉末状目标化合物240毫克，收率76％。1hnmr(400mhz，dmso)δ8.95(d，j＝7.2hz，1h)，8.12(dd，j＝7.2hz，1h)，7.77-7.70(m，2h)，7.65(d，j＝7.3hz，1h)，7.44(d，j＝7.2hz，1h)，7.30(d，j＝7.2hz，1h)，7.16(d，j＝7.3hz，1h)，6.79(d，j＝14.0hz，1h)，5.67(d，j＝14.0hz，1h)，1.44(s，6h)，1.0(s，3h)；13cnmr(100mhz，dmso)δ175.1，155.7，141.2，140.3，137.5，135.2，133.3，130.7，129.9，128.3，127.4，126.4，125.9，124.3，32.5，24.7.
实施例7：
1，3，3-trimethyl-2-((e)-2-(9-oxo-6-((e)-2-(2，3，6，7-tetrahydro-1h，5h-pyrido[3，2，1-ij]quinolin-9-yl)vinyl)-9h-xanthen-3-yl)vinyl)-3h-indol-1-ium
溴代邻硝基苯甲醛(20.0g，0.08mol)、间甲基苯酚(18.6g，0.17mol)、无水氯化铜(890mg，6.6mmol)、三苯基膦(2.6g，10mmol)与无水磷酸钾(62.0g，0.29mol)溶解到100毫升重蒸甲苯中，反应液在110℃条件下回流；反应24小时后反应液冷却到室温，将用硅藻土过滤，并用乙酸乙酯多次清洗滤饼；然后经减压蒸馏将溶剂蒸干。残留物用150毫升乙酸乙酯溶解后，加等量水洗多次，直至水相颜色有深棕色变为澄清；后用40％氢氧化钠水溶液洗多次，直至水相由深棕色变为澄清；最后，饱和食盐水洗3到5次；有机相用无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析分离，干法上样，石油醚比乙酸乙酯50比1；或重结晶，到乳白色粉末状固体或白色针状晶体(20g，75％)。
所得中间体再与本乙烯衍生物，在醋酸钯作用下发生偶联，产物再经nbs溴代，氧化，上述反应得到的化合物(224mg，0.1mmol)和吲哚啉(434mg，0.1mmol)，与1.2个当量的乙醇钠加到50毫升圆底反应瓶中，10毫升dmf溶解，室温下搅拌反应24小时，反应液由最初的深玫红色变为淡黄色，加入10毫升水淬灭反应，20毫升乙酸乙酯萃取，分离水相，再用10毫升水洗涤5到8次，充分将dmf除去，最后无水硫酸钠干燥；有机相减压蒸馏，柱层析纯化，干法上样(pe∶ea＝20∶1)，得淡黑色粉末状目标化合物273毫克，收率55％。1hnmr(400mhz，dmso)δ8.95(d，j＝7.2，1h)，8.12(dd，j＝7.2hz，1h)，7.70(d，j＝7.3hz，1h)，7.65(d，j＝7.3，1h)，7.44(d，j＝7.2，1h)，7.30(d，j＝7.2hz，1h)，7.16(s1h)，7.04(s，2h)，6.79(d，j＝14.0，1h)，5.67(d，j＝14.0，1h)，3.37-3.34(m，4)，2.78-2.71(m，4h)，1，97-1，94(m，4h)，1.44(s，6h)，1.0(s，3h)；13cnmr(100mhz，dmso)δ175.1，155.7，141.2，140.3，137.5，135.2，133.3，130.7，129.9，128.3，127.4，126.4，125.9，124.3，51，7，32.5，28.0，24.7，22.1.
实施例8：荧光化合物的斯托克斯位移和溶剂极性的相关性研究
化合物紫外吸收与荧光光谱测试。将对应染料配置成25um/l甲苯、乙酸乙酯、二氧六环、乙腈和甲醇溶液，分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测试化合物在不同溶液中的紫外吸收和荧光发光谱。然后测算溶剂极性和斯托克斯位移之间的关系。
表1化合物在不同溶剂中的紫外最大吸收和荧光最大发射峰与斯托克斯位移数据。