本发明涉及遗传育种
技术领域：
，尤其是涉及一种用于检测奶牛乳房炎的分子标记的选择确定和应用。
背景技术：
：奶牛乳房炎是影响奶牛业发展的第一大疾病,遗传因素在乳房炎的发生中起着重要作用。寻找奶牛乳房炎抗性基因或者分子标记,从而进行标记辅助性选择，成为目前奶牛抗病育种研究热点。临床乳房炎的遗传力较低，为0.01～0.10(chu等，2012)，在奶牛育种中直接选择的效果差。奶牛体细胞数(somaticcellcount,scc)或体细胞评分(somaticcellscore,scs)遗传力为0.05-0.29(rupp等，1999；heringstad等，2006)，且在生产中便于记录。因此，目前常用scs和scc对奶牛乳房炎进行间接选择(shook，2006；chu等，2012；陈仁金等，2013)。乳腺癌1基因(breasecancer1,brca1)在人类的研究较多，被认为是早期乳房癌症的的易感基因(miki等，1994)，具有参与dna损伤修复、细胞周期调控、转录调控、抑制肿瘤以及确保基因组稳定的作用(xu等，2012)。brca1基因突变与乳房癌高发病率相关(krum等，2003；mahfoudh等，2012)。牛brca1基因位于19号染色体，位于或者靠近scs数量性状位点(qtl)(rebbeck等，1999；kennedy等，2002；bennewitz等，2004；daetwyler等，2008)。技术实现要素：本发明的技术目的是选择和确定用于检测奶牛乳房炎的抗性基因或分子标记，分析该突变与产奶乳房炎的相关性，以为奶牛的分子育种提供依据。本发明首先选定牛brca1基因作为荷斯坦牛乳房炎抗性的有力候选基因。牛brca1基因多态性丰富。据ncbi报道，牛brca1基因snp有2196个。经过研究发现，brca1基因突变与牛的乳房炎相关性很高，故而选定牛brca1基因。紧接着，本发明通过brca1基因外显子14及其侧翼序列克隆和序列比对方法挖掘该基因的多态位点，采用snapshot技术检测了brca1基因50439inst突变位点在北京郊区荷斯坦奶牛群体中的分布，并对突变位点与体细胞评分进行了关联分析。结果表明，荷斯坦奶牛brca1基因50439inst为新发现突变位点，共检测到3种基因型，其中aa基因型为优势基因型，aa基因型体细胞评分高于ab型和bb型(p<0.01)。表明brca1基因50439inst位点的b等位基因可作为荷斯坦牛乳房炎抗性的分子标记使用。在此基础上，本发明提供了牛brca1基因50439inst位点的b等位基因作为检测奶牛乳房炎抗性的分子标记的用途。所述奶牛优选是荷斯坦母牛。本发明进一步提供一种用于检测奶牛乳房炎抗性的分子标记，是brca1基因内含子14上的50439inst位点的b等位基因。可用于乳房炎抗性的奶牛的遗传育种选育。再进一步提供一组引物，其可特异性扩增所述的分子标记。根据一种具体的实施方式，引物的序列优选如下：50439f：tcacattgctaatactacacgttg；50439r：gaaggcttggtcattaggga；50439y(f)：ttttttttttttttttttttttttttttttctatggtggcatcaggc。所述引物具有高度特异性，可快速准确特异性扩增brca1基因内含子14上的50439inst位点附近的基因序列，并准确判断荷斯坦奶牛个体在该位点上的基因型。本发明的引物和方法可制备成成品试剂盒，结合测序仪，可快速准备确定待测奶牛个体在该位点上的基因型，选育优良品种。试剂盒中除包含上述特异性引物外，还含有dna提取试剂、扩增用试剂以及dna纯化回收试剂等。所述的分子标记用于检测奶牛乳房炎抗性的方法，采用上述引物，用snapshot技术进行检测。包括步骤：奶牛dna样品经预扩增、预扩增产物消化、延伸反应、延伸产物纯化后在测序仪检测snp信号。测序仪优选使用3730xl型测序仪。检测结果的分析步骤包括：配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较奶牛体细胞评分在基因型之间的差异：yijkl＝μ+hi+sj+gk+eijkl其中，yijkl为奶牛体细胞评分值；μ为群体平均值；hi为第i个牛场的固定效应；sj为第j头公牛的固定效应；gk为brca1基因第k种基因型的固定效应；eijkl为随机残差效应。分析结果的判定是：brca1基因50439inst位点有3种基因型：野生型aa、杂合型ab和突变纯合型bb，其体细胞评分的最小二乘平均值，突变纯合型bb和杂合型ab的体细胞评分低于野生型aa(p<0.01)。本发明经过对1980头荷斯坦母牛该位点体细胞评分的统计分析发现，本次发现的位于内含子14的50439inst突变为新的snp位点，该新snp位点突变纯合型bb和杂合型ab的体细胞评分低于野生型aa(p<0.01)，说明brca1基因是荷斯坦牛乳房炎抗性的有利基因，50439inst位点的b等位基因可以作为乳房炎抗性的分子标记使用。附图说明图1表示brca1基因内含子14的50439inst突变。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：1材料与方法1.1材料1980头荷斯坦母牛(来自15头公牛家系)血样分别采自北京郊区5个奶牛场，5个奶牛场采样奶牛分别是450、390、410、380、350头。颈静脉采血，所采血样均为10ml/头，柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃冻存。用酚氯仿抽提法提取基因组dna，溶于te缓冲液(10mmol/ltris-hcl(ph8.0)，1mmol/ledta(ph8.0))，4℃保存。根据奶牛dhi数据记录的第一泌乳期的体细胞数(scc)，利用公式scs＝log2(scc/10000)+3计算体细胞评分。1.2筛选brca1基因外显子14及侧翼序列snp多态性以参试奶牛第一胎体细胞数为依据，筛选奶牛乳房炎极端个体。体细胞数极端个体选择的标准为：体细胞数>250万和体细胞数<5万的荷斯坦母牛个体各20头。采用直接测序法筛查brca1基因外显子14及其侧翼序列多态性。设计测序引物扩增brca1外显子14及其侧翼序列，引物序列如表1所示(引物no.1-2)。扩增产物用dna片段快速纯化回收试剂盒纯化，连接到pgem-teasy载体，并转化大肠杆菌(escherichiacoli)top10菌株，酶切鉴定后在3730(abi)测序仪上测序。测序反应由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。taqdna聚合酶、dntps、dna回收和克隆试剂盒等均购自北京天根生物技术有限公司。对测序结果进行比对，寻找brca1基因与乳房炎抗性相关潜在的snp位点。表1奶牛brca1基因检测引物信息在序列表中的位置引物名称引物序列(5′→3′)如seqidno.1所示14fagagggaaccccttatctgaaatc如seqidno.2所示14rgggaaacacatctggagacact如seqidno.3所示50439ftcacattgctaatactacacgttg如seqidno.4所示50439rgaaggcttggtcattaggga如seqidno.5所示50439y(f)ttttttttttttttttttttttttttttttctatggtggcatcaggc1.3snapshot对于参试奶牛群体brca1基因的1个snp位点，50439inst(相对于ac_000176)，利用美国应用生物公司(abi)的snapshot技术进行检测。引物信息如表1所示(引物no.3-5)。奶牛dna样品经预扩增、预扩增产物消化、延伸反应、延伸产物纯化后在3730xl测序仪检测snp信号。1.4统计分析配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较奶牛体细胞评分在基因型之间的差异：yijkl＝μ+hi+sj+gk+eijkl其中，yijkl为奶牛体细胞评分值；μ为群体平均值；hi为第i个牛场的固定效应；sj为第j头公牛的固定效应；gk为brca1基因第k种基因型的固定效应；eijkl为随机残差效应。用sas(6.12版)的glm(generallinearmodel)过程完成。2结果2.1brca1基因外显子14及侧翼序列分析外显子14测序结果与奶牛brca1基因序列(ac_000176)比对后发现内含子14中存在一个50439inst突变(详见图1)。2.2brca1基因50439inst基因型和等位基因频率分析在参试奶牛brca1基因50439inst位点发现3种基因型：aa(野生型)、ab(杂合型)和bb(插入突变型)，3种基因频率和等位基因频率如表2所示，在该位点上野生型是优势基因型。表2brca1基因50439inst位点等位基因频率和基因型频率2.3brca1基因50439inst位点与乳房炎抗性的关联分析brca1基因50439inst位点体细胞评分的最小二乘平均值见表3，该位点插入突变的3种基因型间体细胞评分存在差异，bb和ab基因型体细胞评分比aa型分别降低了1.78和1.31(p<0.01)，bb和ab型体细胞评分之间无差异(p>0.05)。表3brca1基因型与乳房炎抗性的关联性注：同一列不同大写字母表示存在显著差异(p<0.01)，相同小写字母表示无显著差异(p>0.05).3.结论牛brca1基因多态性丰富。据ncbi报道，牛brca1基因snp有2196个。本次发现的位于内含子14的50439inst突变为新的snp位点。经过对1980头荷斯坦母牛该位点体细胞评分的统计分析发现，该新snp位点突变纯合型bb和杂合型ab的体细胞评分低于野生型aa(p<0.01)，说明brca1基因是荷斯坦牛乳房炎抗性的有利候选基因，50439inst位点的b等位基因可以作为乳房炎抗性的分子标记使用。序列表<110>北京市畜牧总站<120>一种检测奶牛乳房炎抗性的分子标记及其用途<130>p1710088<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1agagggaaccccttatctgaaatc24<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gggaaacacatctggagacact22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tcacattgctaatactacacgttg24<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gaaggcttggtcattaggga20<210>5<211>47<212>dna<213>人工序列<400>5ttttttttttttttttttttttttttttttctatggtggcatcaggc47当前第1页12