本发明涉及一种奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
牛奶是最古老的天然饮料之一，被誉为“白色血液”，含有丰富的矿物质，具有很高的营养价值。随着中国经济的发展，人们的生活水平不断提高，对乳品的消费需求增长很快。奶牛乳房炎是制约中国奶牛养殖业发展的主要疾病之一，不仅使产奶量减少造成经济损失，而且使乳的品质大大下降。
奶牛乳房炎(bouinemastitis)是由各种病因引起的乳房的炎症，主要的特点是乳汁发生理化性质及细菌学变化、乳腺组织发生病理变化等。我国奶牛乳房炎的发病很高，据报道，中国大部分地区奶牛乳房炎的检出率在40％～65％之间。引起乳房炎的病原有细菌、病毒、真菌、霉形体等150多种，主要的病原是链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和支原体。其中主要的传染性病原有无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和霉形体(mycoplasma)，环境性病原有大肠杆菌(escherichiacoli)、乳房链球菌(streptococcusuberis)、停乳链球菌(streptococcusdysgalactiae)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、分支杆菌(mycobacteria)、蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(salmonella)、类杆菌(bacteroides)、真菌(fungus)等。
奶牛乳房炎是奶牛场危害最大的疾病之一，严重阻碍了奶牛业的健康发展。目前细菌感染仍是奶牛乳房炎错综复杂的致病因素中最主要的。传统的鉴定方法主要是通过细菌分离鉴定、生化鉴定等经典方法，但经典方法操作繁琐、耗时长、检出率低，对该菌准确检测和疾病及时治疗十分不利。至二十世纪八十年代末聚合链式反应技术诞生，极大地推动了分子生物学科技的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的长足发展，成为最重要的检测技术之一。现有检测奶牛乳房炎病原菌的pcr技术有pcr、多重pcr、实时荧光定量pcr和lamp法等。其中多重pcr具有能够同时检测多种病原，操作简单，成本低的特点。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组，采用该引物组可同时检测无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌4种病原菌，检测效率大大提高。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组，包括检测无乳链球菌sip基因的上游引物sip-f-1和下游引物sip-r-1、检测停乳链球菌isp基因的上游引物isp-f-1和下游引物isp-r-1、乳房链球菌paua基因的上游引物paua-f-1和下游引物paua-r-1、检测金黄色葡萄球菌nuc基因的上游引物nuc-f-1和下游引物nuc-r-1；引物组的核苷酸序列为：
作为优选，通过引物sip-f-1和sip-r-1扩增得到的目的条带大小为605bp；通过引物isp-f-1和isp-r-1扩增得到的目的条带大小为385bp；通过引物paua-f-1和paua-r-1扩增得到的目的条带大小为273bp；通过引物nuc-f-1和nuc-r-1扩增得到的目的条带大小为155bp。
本发明的第二个目的在于提供上述奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组的应用，将该引物组应用于pcr检测方法，该方法检测时间短、成本低、特异性高以及结果判定简单。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种上述的奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组的应用，为将该引物组应用于奶牛乳房炎病原菌多重pcr检测方法中。
作为优选，奶牛乳房炎病原菌多重pcr检测方法的步骤包括：
1)提取样品dna，进行pcr扩增；50μl的pcr检测体系为：
taq酶，3.75u，
10×pcr缓冲液，5μl，
mgcl2，浓度为1.5mmol/l，
dntp，浓度为200μmol/l，
sip-f-1和sip-r-1引物，各自浓度为0.05μmol/l，
isp-f-1和isp-r-1引物，各自浓度为0.06μmol/l，
paua-f-1和paua-r-1引物，各自浓度为0.16μmol/l，
nuc-f-1和nuc-r-1引物，各自浓度为0.16μmol/l，
样品dna模板50ng，
ddh2o补足到50μl；
2)通过琼脂糖凝聚电泳检测扩增产物。
作为优选，步骤1)中，pcr的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，46℃1min，72℃90s，35个循环；72℃，10min。
作为优选，步骤3)中，将得到的电泳图与阳性、阴性对照比较，如果电泳图中在605bp位置存在扩增条带，则说明样品中含有无乳链球菌；如果电泳图中在385bp位置存在扩增条带，则说明样品中含有停乳链球菌；如果电泳图在273bp位置存在扩增条带，则说明样品中含有乳房链球菌；如果电泳图在155bp位置存在扩增条带，则说明样品中含有金黄色葡萄球菌；如果没有出现上述的条带，则说明样品中不含有相应的菌。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组，采用该引物组可同时检测无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌4种病原菌，检测效率大大提高；
2、本发明将引物组应用于多重pcr检测方法中，该检测方法可快速、高效、准确的检测出待检样品是否为无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌致病菌的单一或混合感染；此外，本检测方法也可用于奶牛感染无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌的流行病学调查及疗效监测，并可对临床、亚临床乳房炎的治疗提供科学依据，而且对提高乳房炎的检测、监控水平，保障牛奶及其乳制品食品安全具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2特异性评估试验结果；
图2为实施例3无乳链球菌的敏感性评估试验结果；
图3为实施例3停乳链球菌的敏感性评估试验结果；
图4为实施例3乳房链球菌的敏感性评估试验结果；
图5为实施例3金黄色葡萄球菌的敏感性评估试验结果。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1：pmd-18t-paua重组载体的构建
根据genbank公布的无乳链球菌sip基因(登录号hq878436)、停乳链球菌isp基因(登录号cp002215)、乳房链球菌paua基因(登录号kt006567.1)、金黄色葡萄球菌nuc基因(登录号dq399678)设计引物，得到：扩增无乳链球菌sip基因的上游引物sip-f-2和下游引物sip-r-2、扩增停乳链球菌isp基因的上游引物isp-f-2和下游引物isp-r-2、扩增乳房链球菌paua基因的上游引物paua-f-2和下游引物paua-r-2、扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的上游引物nuc-f-2和下游引物nuc-r-2；引物的核苷酸序列为：
然后以基因组dna为模板，扩增sip、isp、paua和nuc全长序列，目的片段连接pmd-18t载体，经pcr鉴定，阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列经blast比对，pmd-18t-sip与sip基因序列相似性为99％，序列如seqidno.17所示；pmd-18t-isp与isp基因序列相似性为99％，序列如seqidno.18所示；pmd-18t-paua与paua基因序列相似性为100％，序列如seqidno.19所示；pmd-18t-nuc与nuc基因序列相似性为99％，序列如seqidno.20所示。说明成功获得了sip、isp、paua和nuc基因，将获得的基因用于后续试验。
实施例2：特异性评估试验
对临床分离并由本实验室保存的无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和蜡样芽孢杆菌进行pcr扩增反应，
50μl的pcr检测体系为：
taq酶，3.75u，
10×pcr缓冲液，5μl，
mgcl2，浓度为1.5mmol/l，
dntp，浓度为200μmol/l，
sip-f-1和sip-r-1引物，各自浓度为0.05μmol/l，
isp-f-1和isp-r-1引物，各自浓度为0.06μmol/l，
paua-f-1和paua-r-1引物，各自浓度为0.16μmol/l，
nuc-f-1和nuc-r-1引物，各自浓度为0.16μmol/l，
样品dna模板50ng，
ddh2o补足到50μl；
pcr的条件为：95℃5min；95℃30s，46℃1min，72℃90s，35个循环；72℃，10min。
引物的核苷酸序列为：
设置实施例1中的四种重组载体和无菌ddh2o分别为阳性和阴性对照。1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。
特异性评估试验结果如图1所示，图中泳道m：dl1,000dnamarker，泳道1含有无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌，泳道2-11分别为无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎链球菌、阴性对照和阳性对照。从图中可以看出，除对应菌出现相应条带及阳性对照外，其余样品的扩增结果均未见单一的目的条带，表明该方法特异性良好。
实施例3：敏感性评估试验
提取实施例1中所构建重组载体，无菌ddh2o以10倍梯度稀释，取拷贝数为108、107、106、105、104、103、102的7个浓度梯度分别为模板，设置无菌ddh2o为阴性对照。pcr反应体系于实施例2相同。1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。
无乳链球菌的敏感性评估试验结果如图2所示，图中泳道1-7分别为：拷贝数为108、107、106、105、104、103、102的重组载体，泳道8为无菌ddh2o阴性对照，泳道9为四种重组载体阳性对照，泳道m：dl1,000dnamarker。从图中可以看出，pcr的检测限为105拷贝数。
停乳链球菌敏感性评估试验结果见图3，图中泳道1-7分别为：拷贝数为108、107、106、105、104、103、102的重组载体，泳道8为无菌ddh2o阴性对照，泳道9为四种重组载体阳性对照，泳道m：dl1,000dnamarker。从图中可以看出，pcr的检测限为104拷贝数。
乳房链球菌敏感性评估试验结果见图4，图中泳道1-7分别为：拷贝数为108、107、106、105、104、103、102的重组载体，泳道8为无菌ddh2o阴性对照，泳道9为四种重组载体阳性对照，泳道m：dl1,000dnamarker。从图中可以看出，pcr的检测限为105拷贝数。
金黄色葡萄球菌敏感性评估试验结果见图5，图中泳道1-7分别为：拷贝数为108、107、106、105、104、103、102的重组载体，泳道8为无菌ddh2o阴性对照，泳道9为四种重组载体阳性对照，泳道m：dl1,000dnamarker。从图中可以看出，pcr的检测限为105拷贝数。
通过上述实施证明，所建立的一种奶牛乳房病原菌多重pcr检测方法有良好的特异性和较好的灵敏性，该方法具有非常高的可靠性。
因此，本研究建立了针对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的多重pcr诊断方法，能够快速、准确的同时对此四种常见病原菌进行检测，为奶牛乳房炎的综合防治研究提供技术支持。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
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<110>广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120>一种奶牛乳房炎病原菌的多重pcr检测引物组及其应用
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