本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种特异性甲基化检测引物及子宫内膜异位症诊断试剂盒。
背景技术：
子宫内膜异位症(endometriosis，内异症)是引起盆腔疼痛和不孕的常见因素,是指具有生长功能的子宫内膜组织在子宫腔被覆粘膜以外的其他部位生长、浸润、反复出血,可形成结节及包块。子宫内膜异位症是激素依赖性疾病，主要见于育龄妇女。近年来，其发病率越来越高，育龄妇女中的发病率约为10％，然而，由于它与不孕和盆腔痛的关系，在这些女性人群中，其患病率明显要高，已成为妇科常见病。据报道，不孕症妇女的内异症患病率为25％-35％，盆腔痛的妇女达39-59％。而内异症患者50％的病人有明显的痛经，30％合并不孕，严重地影响中青年妇女的健康和生活质量。
子宫内膜异位症为妇科良性疾病，但具有恶性行为，发病率逐年上升，临床早期误诊率可达70％。而且，内异症的早期诊断比较困难，容易漏诊。现有的诊断方法有：
影像学诊断：如超声、ct、mri等，但主要适合于子宫内膜异位症囊肿的患者，有一定的局限性。
血ca125测定：ca125是一种高分子糖蛋白结构的抗原，开始只是上皮性卵巢癌的肿瘤标志物。上世纪80年代以来，学者们逐渐发现ca125余子宫内膜异位症有密切关系：子宫内膜异位症患者的血清ca125水平明显高于正常生育期妇女。在i～ii期患者中，血清ca125水平虽有升高，但与正常妇女有交叉；而iii～ⅳ期等重度患者中，血清ca125水平越高，病情越重。以血清ca125升高为诊断标准，敏感性50～68％。血清ca125的测定对内异症诊断有一定的意义，但是按美国生育协会对内异症分期的标准，只有iii～ⅳ期有卵巢子宫内膜异位囊肿、病灶浸润较深、盆腔粘连广泛者血ca125阳性率较多，i～ii期子宫内膜异位症血ca125多正常。因此，血清ca125对内异症的诊断特异性低，提示ca125阴性者亦不能排除内异症。
血清抗体检测：已知子宫内膜异位症是一种自身免疫性疾病，内异症患者患者由于细胞免疫缺陷，子宫内膜中某些抗原在激素作用下表达与患者血清中可溶性的抗原，从而产生抗体，即子宫内膜抗体。正常妇女血清中的子宫内膜抗体阴性或在一基线水平，它的存在可能与不孕有关，内异症患者的血清子宫内膜抗体阳性率在60％以上。虽然有一定的诊断价值，但也存在局限性，因为子宫内膜抗原的制备和检测方法的不同有较大差异。
腹腔镜：腹腔镜是诊断子宫内膜异位症的最佳方法，特别是对不明原因不育或腹痛者首选腹腔镜检查，当镜下看到典型子宫内膜异位症时，即可确定诊断。不过，肉眼诊断的子宫内膜异位病灶，只有约70％得到病理证实。
目前已有研究表明，sf-1基因的表达水平与子宫内膜异位有关，已经发现sf-1在非内异症患者在位子宫内膜和内异症患者异位内膜中的表达存在差异，在异位内膜中表达异常增高最显著，异位病灶中如此的高表达说明sf-1是内异症的一个非常重要的致病因子。而该基因近端启动子区域cpg位点的甲基化水平则影响着sf-1基因的表达水平，因此，判断sf-1启动子区域cpg位点甲基化的状态有潜力成为早期诊断子宫内膜异位症的诊断手段。然而，通过sf-1启动子区域的甲基化水平来诊断子宫内膜异位症的精确度和灵敏度不够高，一方面，目前发现在少数子宫内膜异位症患者中，sf-1启动子区域仍存在一定的甲基化状态；另一方面，目前检测甲基化状态的常规方法是首先采用亚硫酸氢盐对胞嘧啶进行修饰，再进行测序，依此来判断某位点的甲基化状态，但该方法的精确性和灵敏性受亚硫酸氢盐修饰反应效率的影响，可能会出现假阳性的情况，进而影响诊断的精确性和灵敏性。即仅判断该基因启动子区域的甲基化状态，仍会存在一定的假阴性或假阳性，因此，本领域迫切需要寻找更多的sf-1基因甲基化位点，与其启动子区域的cpg位点组合使用，使得能够提高基因诊断的精确性和灵敏度，以便进行及时、有针对性的治疗，改善育龄期妇女的生活质量。
技术实现要素：
为了在患病初期精确、灵敏地发现病症，协助治疗患者，做到早诊断早治疗，改善患者妊娠结局和生活质量，本发明提供一种用于子宫内膜异位症诊断的特异性甲基化检测的引物及试剂盒，本发明提供的引物和试剂盒通过扩增sf-1基因的多个cpg岛，并对扩增产物测序分析，客观地判断待测样本是否是发生了子宫内膜异位症患者的样本，从而实现子宫内膜异位症的高精度、高灵敏度诊断，本发明方法操作简单，成本低廉，有利于预后目标的监测。
子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病，芳香化酶是雌激素合成过程中的关键限速酶，催化雄激素转化为雌激素，是子宫内膜异位症发生的重要致病因子，而类固醇基因因子1(sf-1)可结合到芳香化酶的启动子区调控其表达。本发明的发明人经过大量实验研究和验证，首次发现了sf-1基因在其内含子/外显子中也存在可被甲基化的cpg岛，该内含子/外显子的cpg岛与传统的启动子区域甲基化关闭基因表达的理论相反，即在位内膜时低甲基化而基因不表达，但在异位内膜时却高度甲基化而基因高度表达。即异位病灶组织与正常人内膜相比，sf-1的启动子区域位点和内含子/外显子区域位点的甲基化水平存在相反的关系，因此，在同一次诊断中同时检测这两个区域的甲基化水平，可以最大程度地避免由于亚硫酸氢盐修饰反应效率所带来的假阳性，即两者可以互为各自的阴性对照。
此外，在部分子宫内膜异位症患者中，sf-1启动子区域仍存在一定的甲基化水平，仅通过检测sf-1启动子区域的甲基化水平尚无法精确、准确地对其是否患病进行诊断，如果与检测sf-1基因中内含子/外显子的甲基化状态相结合，两者可以有效地实现互补，比起单独检测sf-1基因启动子区域的甲基化状态，同时检测二者甲基化状态可以更加精确、灵敏地诊断和预测疾病状态。
为实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种检测sf-1基因特异性甲基化的引物，其扩增经亚硫酸氢钠修饰的sf-1基因的至少一个cpg岛，包括：
如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物组成的第一引物对；和
如seqidno.3所示的上游引物和如seqidno.4所示的下游引物组成的第二引物对。
对扩增获得的cpg岛进行测序分析可以获得sf-1基因上启动子区域及内含子/外显子区域的甲基化位点信息，根据甲基化位点信息可以判断待测样本是否是发生了子宫内膜异位症患者的样本，从而实现子宫内膜异位症的诊断。
为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供一种将第一方面所述的引物应用于检测子宫内膜异位症的用途。
其中，所述用途包括：将利用引物扩增获得的所述cpg岛进行启动子区域位点和内含子/外显子区域位点的甲基化信息分析，根据启动子区域位点和内含子/外显子区域位点甲基化位点信息判断待测样本是否是发生了子宫内膜异位症的样本。
其中，所述甲基化位点信息包括自sf-1基因转录起始点起第+7、+121、+4114和+4215位点的信息。
本发明第三方面还提供一种将第一方面所述的引物应用于制备检测人内异症试剂中的应用。
为实现本发明的技术目的，本发明第四方面提供一种子宫内膜异位症诊断的试剂盒，其通过扩增经亚硫酸氢钠修饰的待测样本的sf-1基因中的至少一个cpg岛，并同时检测sf-1基因的启动子区域位点和内含子/外显子区域位点的甲基化信息，判断待测样本是否为子宫内膜异位症患者样本，包括pcrmastermix和扩增引物，其中，所述特异性引物包括：
如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物组成的第一引物对；
如seqidno.3所示的上游引物和如seqidno.4所示的下游引物组成的第二引物对。
其中，所述启动子区域位点为第+7和第+121位。
其中，所述内含子/外显子区域位点为第+4114和+4215位。
特别是，所述通过扩增经亚硫酸氢钠修饰的待测样本的sf-1基因中的至少一个cpg岛，并同时检测sf-1基因的启动子区域位点和内含子/外显子区域位点的甲基化信息，判断待测样本是否为子宫内膜异位症患者样本包括：
对待测样本提取的dna进行亚硫酸氢盐修饰，使样本sf-1基因cpg岛中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
对所述经过亚硫酸氢盐修饰的样本dna进行pcr扩增处理，获得大量sf-1基因片段；
对所述sf-1基因片段依次进行纯化、ta克隆，取阳性克隆进行测序并同时分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，得到待测样本是否为子宫内膜异位症患者样本的诊断结果。
其中，所述位点发生甲基化评价指标是：基因的某甲基化位点的胞嘧啶(c)经亚硫酸盐修饰后变为尿嘧啶(u)；位点未发生甲基化评价指标是：基因的某甲基化位点的胞嘧啶(c)经亚硫酸盐修饰后未发生变化。
其中，取所述阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，得到待测样本是否为子宫内膜异位症患者样本的诊断结果包括：
将阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，若自sf-1基因的转录起始点起的第+7或/和+121位点未发生甲基化、第+4114或/和+4215位点发生甲基化，则诊断待测样本是患有子宫内膜异位症的样本；
将阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，若自sf-1基因的转录起始点起的第+7或/和+121位点发生甲基化、第+4114或/和+4215位点未发生甲基化则诊断待测样本不是患有子宫内膜异位症的样本。
其中，所述对经过亚硫酸氢盐修饰的样本dna进行pcr扩增处理，用于获得sf-1基因片段的特异性引物的扩增处理包括：建立以待测样本的dna为模板，以seqidno.1-4建立的反应体系在90℃10min，40个循环(95℃30s、50℃2min、72℃2min)，72℃7min的扩增条件下进行扩增处理。
其中，所述待测样本包括临床疑似待诊的异位子宫内膜病灶组织。
本发明还提供一种使用第四方面的试剂盒方法。包括：
对待测样本提取的dna进行亚硫酸氢盐修饰，使样本sf-1基因cpg岛中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
对所述经过亚硫酸氢钠处理的样本dna进行pcr扩增处理，用于获得大量sf-1基因片段；
对所述sf-1基因片段依次进行纯化、ta克隆，取阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，得到待测样本是否为子宫内膜异位症患者样本的诊断结果。
其中，所述将阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，得到待测样本是否为子宫内膜异位症患者样本的诊断结果包括：
将阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，若自sf-1基因的转录起始点起的第+7或/和+121位点未发生甲基化、第+4114或/和+4215位点发生甲基化，则诊断待测样本是患有子宫内膜异位症的样本；
将阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，若自sf-1基因的转录起始点起的第+7或/和+121位点发生甲基化、第+4114或/和+4215位点未发生甲基化则诊断待测样本不是患有子宫内膜异位症的样本。
其中，所述位点发生甲基化评价指标是：基因的某甲基化位点的胞嘧啶(c)经亚硫酸盐修饰后变为尿嘧啶(u)；位点未发生甲基化评价指标是：基因的某甲基化位点的胞嘧啶(c)经亚硫酸盐修饰后未发生变化。
其中，所述对经过亚硫酸氢盐修饰的样本dna进行pcr扩增处理，用于获得sf-1基因片段的特异性引物的扩增处理包括：建立以待测样本的dna为模板，以seqidno.1-4建立的反应体系在90℃10min，40个循环(95℃30s、50℃2min、72℃2min)，72℃7min的扩增条件下进行扩增处理。
其中，所述扩增体系中还包括pcrmastermix。
本发明还在于提供一种将sf-1基因作为子宫内膜异位症的标志物的用途，利用本发明第一方面提供的引物或第四方面提供的试剂盒对亚硫酸氢钠修饰后的待测样本的sf-1基因进行扩增及甲基化分析，可以判断待测样本是否为子宫内膜异位症样本。
本发明的有益效果：
本发明应用sf-1基因为标志物，对待测样本的两个dna甲基化位点的甲基化状态进行检测，可以准确的对样本的子宫内膜异位症进行提示，及时有效的提早预知患者疾病趋势，协助治疗患者，改善患者的生活质量。
附图说明
图1是正常人与内异症患者的甲基化位点示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。
在下面的描述中阐述了很多具体的细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
实施例1试剂盒
试剂盒中包括：pcrmastermix，以及：
第一引物对：如seqidno.1所示的上游引物和如seqidno.2所示的下游引物；
第二引物对：如seqidno.3所示的上游引物和如seqidno.4所示的下游引物。
其中，试剂盒的使用条件是：90℃10min，40个循环(95℃30s、50℃2min、72℃2min)，72℃7min。
本发明所使用的pcrmastermix可以是市售的任一一种可以实现dnapcr扩增的混合物试剂，例如appliedbiosystems公司提供的amplitaqgoldpcrmastermix。
实施例2子宫内膜异位症的诊断
1、样本采集及dna的提取
少量获取子宫内膜异位症病灶组织，用酶原法消化、分离和培养子宫内膜间质细胞，使用dna提取试剂盒对培养的子宫内膜间质细胞进行提取。提取方法参照试剂盒(dneasytissuekit,qiagen,valencia,ca)的操作说明进行。
2、碱基修饰
取500ngdna进行亚硫酸氢盐修饰(按照试剂盒ezdnamethylationkit,zymoresearch,orange,ca操作说明书进行)，dna中未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。
3、pcr扩增
取上述3ul亚硫酸氢钠处理过的dna加入到amplitaqgoldpcrmastermix(appliedbiosystems)中形成20ul的pcr反应体系进行pcr扩增，其中所用引物为：
第一引物对：f5’-tgtagaaggaggttggttattagag-3’；
r5’-aacraacaaaaccaacctactatcc-3’；
第二引物对：f5’-gaaggttaatggtattatttttttag-3’；
r5’-cacrtataaaaaactacaaaataaac-3’。
4、纯化处理
将上述的pcr扩增产物通过1.5％dna凝胶电泳进行纯化，两对引物扩增得到相对应dna片段的大小分别为213bp和333bp。
5、ta克隆处理
将纯化后的dna片段克隆到pgem-teasyvector(promega,madison,wi)中，然后挑选6-8个含有正确插入序列的克隆进行下一步的测序。
6、甲基化位点分析及提示的获得
将获得的阳性克隆进行测序并分析第+7、+121、+4114、+4215位点是否发生甲基化，(测序工作可由公司进行，例如：北京友谊中联生物科技有限公司)。
以基因转录起始点为+1，若第+7或/和+121位点未发生甲基化，+4114或/和+4215位点发生甲基化，则诊断为患有子宫内膜异位症，其中，正常人与内异症患者的甲基化位点示意图如图1所示。
实施例3样本检测
1、样本信息
选取因患子宫肌瘤行子宫切除的非内异症患者的在位子宫内膜组织7例作为对照组，选取内异症患者的异位子宫内膜组织7例作为实验组。
2、样本检测
分别提取实验组和对照组的dna，dna的提取可以采用市售的任一一种可以实现dna提取的试剂盒，提取方法参照试剂盒说明书操作，挑选实验组和对照组中每个样本的6-8个克隆应用实施例1中的试剂盒即实施例2中的方法进行子宫内膜异位症的检测，检测结果如表1所示。
表1实验组的检测结果
其中，表中分数b/a的意义为:a表示每个样本获得的阳性克隆总数；b表示每个样本中位点发生甲基化或非甲基化的克隆数。
根据表1的检测结果可知，当待测样本中自转录起始位点起的第+7或/和+121未发生甲基化，+4114位点或/和+4215位点发生甲基化，则样本均为子宫内膜异位症患者样本。
根据表1的试验结果还可以看出，在实验组样本之中，以nyz0007为例，sf-1基因的第+7位点的6个阳性克隆中未甲基化克隆数仅为3，sf-1基因的第+121位点的6个阳性克隆中未甲基化克隆数仅为4，可见sf-1基因的第+7位点及第+121位点仍出现了一定的甲基化水平，如果仅从第+7或/和+121位点的甲基化状态来看，难以判断这些样本是否为子宫内膜异位症患者，因此结合这些样本的第+4114位点和第+4215位点的甲基化水平(如表1所示实验组第+4114位点与第+4215位点均为甲基化克隆)可以推断nyz0007试验组样本为子宫内膜异位症患者样本，可见，将sf-1基因的第+7位点和第+121位点与第+4114位点和第+4215位点共同进行判断可以准确地诊断该样本应当是子宫内膜异位症患者，避免出现了假阴性的结果，精确度提高。
可见，利用本发明的引物及试剂盒可以准确的判断样本是否为子宫内膜异位症患者样本，方法简单、操作简便，成本低，普适性广。
尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。
序列表
序列表
<110>北京大学第一医院
<120>一种用于子宫内膜异位症诊断的特异性甲基化检测的引物和试剂盒
<160>5<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
tgtagaaggaggttggttattagag25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
aacraacaaaaccaacctactatcc25
<210>3
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
gaaggttaatggtattatttttttag26
<210>4
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
cacrtataaaaaactacaaaataaac26
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