本发明涉及一种检测n-ras基因突变的引物、探针和检测产品，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：许多肿瘤细胞中都有ras突变，其中与急性髓细胞白血病(aml)相关的主要基因是nras，由于ras突变对肿瘤的影响大多集中在ras/raf/mek/erk通路上，所以现在针对ras突变的靶向抗肿瘤药物主要集中在对该信号通路中的不同节点的靶向干预上,对人类nras基因突变情况进行检测能指导医生对癌症患者进行治疗和预后。探索患者n-ras耐药机制及预测预后成为一条可行的途径，现在已经明确肿瘤细胞会释放dna进入循环系统，使得通过“液态活检”的方式，能够对早期及晚期肿瘤患者特定的核酸序列进行分析，是一种非侵入性的检测肿瘤基因及临床治疗效果的一种方法，而且患者对非侵入性样本采集方式的接受度更高。但是由于大多数人血清/血浆中cfdna含量低，在肿瘤早期阶段，ctdna仅占总游离dna的0.01％，且cfdna片段相对小等原因，目前对肿瘤相关基因的临床检测主要是测序法和arms法，并不适用。因此，ctdna的检测就需要一种比常规方法更灵敏更特异的技术。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dpcr)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。数字pcr由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。数字pcr技术在单分子扩增后对样品dna精确定量，具有比其他pcr更高的测量精度。数字pcr的灵敏度主要取决于2个主要的方面：样品中核酸提取的效率和具体检测体系的灵敏度，两者一起决定了目标序列的检测灵敏度。微滴式数字pcr检测极低拷贝数样本时其检测结果不稳定，需要多次平行实验。由于硬件设备的限制，很难很难实现多个位点的同时检测，并且dpcr多重检测体系受限于pcr扩增产物的长度，对taqman探针的设计有着非常高的要求。本发明从数字pcr检测体系改进，提高数字pcr检测的稳定性和灵敏度。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行多重pcr检测的n-ras基因突变检测引物探针及其试剂盒。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种n-ras基因突变检测引物探针，包括用于检测第12密码子的上下游引物a、第12密码子g12s位点突变的探针a和第12密码子g12d位点突变的探针b，用于检测第13密码子的上下游引物b、第13密码子g13r位点突变的探针c和第13密码子g13a位点突变的探针d，以及用于检测第61密码子的上下游引物c、第61密码子q61k位点突变的探针e、第61密码子q61l位点突变的探针f、第61密码子q61p位点突变的探针g和第61密码子q61r位点突变的探针h；所述上游引物a的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述探针a的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述探针b的核苷酸序列如seqidno.4所示，，所述上游引物b的核苷酸序列如seqidno.5所示，所述下游引物b的核苷酸序列如seqidno.6所示，所述探针c的核苷酸序列如seqidno.7所示，所述探针d的核苷酸序列如seqidno.8所示，所述上游引物c的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述下游引物c的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述探针e的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述探针f的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述探针g的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述探针h的核苷酸序列如seqidno.14所示。上述探针a、b、c、d、e、f、g、h进行了lna修饰。上述上下游引物a、b、c在反应体系中的最终浓度均为0.3～0.5μm/l，探针a、b、c、d、e、f、g、h在反应体系中的最终浓度均为0.15～0.30μm/l。上述上下游引物a、b、c在反应体系中的最终浓度均为0.41μm/l所述探针a、b、c、d、e、f、g、h在反应体系中的最终浓度分别为0.21μm/l、0.22μm/l、0.18μm/l、0.19μm/l、0.19μm/l、0.18μm/l、0.22μm/l、0.21μm/l。上述探针a、b、c、d、e、f、g、h的5’端设有报告荧光基团，3’端设有淬灭荧光基团。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述的引物探针的n-ras基因突变检测产品。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种n-ras基因突变检测试剂盒，包括用于配制数字pcr反应液的数字pcr预混液、液滴稳定剂、检测液a和检测液b；所述检测液a包括用于检测第12密码子的上下游引物a、第12密码子g12s位点突变的探针a和第12密码子g12d位点突变的探针b，以及用于检测第61密码子的上下游引物c、第61密码子q61k位点突变的探针e和第61密码子q61l位点突变的探针f；所述检测液b包括用于检测第13密码子的上下游引物b、第13密码子g13r位点突变的探针c和第13密码子g13a位点突变的探针d，以及用于检测第61密码子的上下游引物c、第61密码子q61p位点突变的探针g和第61密码子q61r位点突变的探针h；所述上游引物a的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述探针a的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述探针b的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述上游引物b的核苷酸序列如seqidno.5所示，所述下游引物b的核苷酸序列如seqidno.6所示，所述探针c的核苷酸序列如seqidno.7所示，所述探针d的核苷酸序列如seqidno.8所示，所述上游引物c的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述下游引物c的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述探针e的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述探针f的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述探针g的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述探针h的核苷酸序列如seqidno.14所示。上述探针a、b、c、d、e、f、g、h进行了lna修饰；所述上下游引物a、b、c在反应体系中的最终浓度均为0.3～0.5μm/l，探针a、b、c、d、e、f、g、h在反应体系中的最终浓度均为0.15～0.30μm/l；所述探针a、b、c、d、e、f、g、h的5’端设有报告荧光基团，3’端设有淬灭荧光基团。上述n-ras基因突变检测试剂盒还包括组蛋白脱乙酰化酶溶液,所述数字pcr预混液中包括dna聚合酶、超纯水、dntps混合液、参比荧光rox和缓冲液；所述液滴稳定剂中包括矿物油。上述n-ras基因突变检测试剂盒反应时，反应体系中包括数字pcr预混液10体积，检测液a或b2体积，液滴稳定剂2体积，模板1体积，灭菌超纯水5体积，所述模板的使用浓度为0.1ng/ul～1ng/ul。本发明具有积极的效果：1)本发明的n-ras基因突变检测试剂盒与常规多重引物设计原则不同，本发明的产物长度和引物长度较短，并对引物和探针进行特殊的修饰，提高了针对突变位点和野生型位点各自探针的特异性，达到探针和靶序列特异性结合的目的，对检测体系优化，使得本发明的灵敏度为0.01％，特异性为100％，能够对更低突变丰度的样本进行检测。2)本发明的n-ras基因突变检测试剂盒除具有超高灵敏度外，还可进行多重pcr分析。通过设计探针的荧光信号和调节探针浓度达到4重检测，由原来的1个芯片检测1个n-ras突变样本变为1个芯片检测4个n-ras突变样本，检测成本节约50-100元，极大的降低了成本。在高通量样本情况下对突变实现快速、经济、灵敏的检测。3)本发明的n-ras基因突变检测试剂盒对反应体系的样本抽提、探针修饰方式和程序进行优化，样本处理过程优化避免了预处理步骤对检测结果准确性的不良影响，探针优化有效避免多重pcr探针之间的抑制并导致扩增效率不稳定，保证了在同一个反应体系进行4重检测的稳定性。ddpcr和多重技术的结合提高了遗传分析的通量，使得能从每个患者样本中获得更多信息。患者对非侵入性样本采集方式的接受度更高，通过该试剂盒绝对定量对肿瘤患者进行了时间和空间分析，改变肿瘤突变阶段分析中的取样方式，可以有效地监测肿瘤患者的ctdna水平(每ml血浆中突变等位基因的拷贝数)表现，不仅能从n-ras突变“有”或“无”突变质的差异，到“多”或“少”突变的量差异，及时反应治疗情况，从而影响治疗方案的选择和决定，更好为临床用药提供理论依据。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。一、试剂盒的组成。本实施例的n-ras基因突变检测试剂盒，包括数字pcr预混液、液滴稳定剂、引物探针混合液、组蛋白脱乙酰化酶溶液和阳性对照。试剂盒各成分如表1所示。表1试剂盒成分表成分分装试剂公司数字pcr预混液1管lifetechnologies液滴稳定剂1管raindancetechnologies引物探针混合液1管百力格阳性对照1管——组蛋白脱乙酰化酶1管北京索莱宝科技有限公司上述表1中试剂盒组分的说明如下：1)数字pcr预混液的主要成分包括dna聚合酶、超纯水、dntps混合液、参比荧光rox、缓冲液等(由lifetechnologies公司提供，货号：1508099)。2)液滴稳定剂的主要成分是矿物油，(由raindancetechnologies公司提供，货号：30-00826)，主要作用是微滴化处理过程将反应体系形成油包水小液滴。3)引物探针混合液包括用于检测n-ras基因第12、13、61密码子的引物和探针，分别是用于检测第12密码子的上下游引物a、第12密码子g12s位点突变的探针a和第12密码子g12d位点突变的探针b，用于检测第13密码子的上下游引物b、第13密码子g13r位点突变的探针c和第13密码子g13a位点突变的探针d，用于检测第61密码子的上下游引物c、第61密码子q61k位点突变的探针、e、第61密码子q61l位点突变的探针f、第61密码子q61p位点突变的探针g和第61密码子q61r位点突变的探针h。本实施例对探针a、b、c、d进行了lna修饰。即在寡核苷酸探针中引入一个lna碱基，并通过调整lna碱基在探针中的位置来调节最佳熔点(tm)和杂交的特异性。经过修饰后的探针具有更高的tm值，能够更好与突变模板结合，修饰后的实时定量pcr探针，长度较短，可以增加设计的灵活性，过lna修饰的突变探针对突变型有更好的突变型能有更好的分簇效果。按照仪器和多重实验的要求，某种特定的突变形式需要用两条不同荧光标记的taqman探针，使用vic和fam两种荧光对taqman探针5’端进行标记，使用mgb淬灭基团对taqman探针3’端进行标记。如果引物和探针的设计不当,则直接影响对关键靶序列的选择,降低pcr检测的灵敏度和特异性,甚至完全失败。因而,必须对扩增序列有充分的了解,并规范pcr实验室操作技术,针对野生和突变使用相同的上游引物和下游引物，防止由于引物过多相互干扰，降低检测的灵敏度。探针a、探针b、探针e、探针f的5’端荧光标记的是fam，探针c、探针d、探针g、探针h的的5’端荧光标记的是vic，当检测模板(dna模板)发生突变时，相应的检测探针有vic荧光信号或fam荧光信号。本实施例的n-ras基因突变检测试剂盒中引物探针混合液分为两管，分别是检测液a和检测液b，检测液a中包括上下游引物a、探针a、探针b、上下游引物c和探针e、探针f，检测液b中包括上下游引物b、探针c、探针d、上下游引物c、探针g和探针h。4)组蛋白脱乙酰化酶是由北京索莱宝科技有限公司提供，根据产品说明书将酶稀释至10ug\ml，每毫升血清或者血浆加入10ul稀释液。5)阳性对照来源于携带n-ras基因突变的阳性细胞株(包括第12、第13和第61密码子在内的突变型)，突变型与野生型n-ras基因的dna按照比例为1:100。二、引物探针设计。由于肿瘤游离dna的长度很短,长度≤180bp，血液中正常细胞的裂解会释放大量的dna，进一步降低ctdna的丰度。核酸酶也会影响血液中ctdna的稳定性，使得部分目标片段序列可能会更短，如果设计引物的扩增产物过长，导致突变的序列不能检测出来，本发明根据改变检测产物长度，发现较短产物突变检出率较长产物突变检出率具有更大的优势，更有利于实现n-ras突变的检出。本发明设计的引物探针长度为14～18bp，产物长度50～80bp，防止由于扩增产物扩增过长导致检测阳性率降低，如表2所示。表2引物探针序列表引物探针有上海百力格生物技术有限公司合成，按照引物说明书由干粉稀释成工作母液，再由母液配置成检测工作液，引物和探针混合液均由母液加入灭菌超纯水稀释而成。过高的探针浓度会提高与野生型模板错配的概率，为满足多重数字pcr设计时的需要，根据不同的荧光标记，且通过调整探针浓度使得不同突变类型的液滴得以在二维平面中区分。用于检测第12密码子的上下游引物a在反应体系中的最终浓度为0.3～0.5μm/l，优选的最终反应浓度为0.41μm/l；用于检测第13密码子的上下游引物b在反应体系中的最终浓度为0.3～0.5μm/l，优选的最终反应浓度为0.41μm/l；用于检测第61密码子的上下游引物c在反应体系中的最终浓度为0.3～0.5μm/l，优选的最终反应浓度为0.41μm/l；探针a、b、c、d、e、f、g、h在反应体系中的最终浓度为0.15～0.30μm/l，优选的最终反应浓度分别为0.21μm/l、0.22μm/l、0.18μm/l、0.19μm/l、0.19μm/l、0.18μm/l、0.22μm/l、0.21μm/l。三试剂盒的使用方法。1、样本dna提取dna来源可以是血清/血浆、血浆、外周血、口腔黏膜等。采集50例肿瘤患者的血清/血浆样本5ml，高速离心，分离上清，得到血清/血浆。用德国qiagen公司提供的血清/血浆总dna提取试剂盒(货号：55114)，按照试剂盒操作说明书抽提患者血清/血浆中的游离dna。获得血清/血浆样本游离dna后，通过thermo-fisher公司3.0核酸蛋白荧光定量仪，测定血清/血浆样本游离dna浓度和纯度，-20℃保存。由于采血后血液内的血液中正常细胞等会裂解，释放大量的dna，降低ctdna的丰度，核酸酶也会影响血液中ctdna的稳定性会，对ctdna的检测造成两方面的影响，加大ctdna检测的难度。本实施例针对大量检测样本，由于不能及时对样本进行后续检测，在分离后的血浆或者抽提后的dna样本中加入组蛋白脱乙酰化酶(sir2酶)，能够保证ctdna的稳定性，并且酶在高温下失活，并不影响后续的扩增实验。2、数字pcr反应液制备根据表3中的pcr反应体系，取试剂盒中20μl的数字pcr预混液、4μl的引物探针混合液，加入2ul的模板、4μl的液滴稳定剂，加入灭菌超纯水补至40μl，制得数字pcr反应反应液，配制定量反应体系，振荡混匀，离心除气泡。模板是指血清/血浆样本稀释后的样本dna和阴性对照，阴性对照为高压灭菌水。表3pcr反应体系表反应成分加入浓度加入体积数字pcr预混液2×20ul检测液a/b---4ul液滴稳定剂10×4ul模板0.1ng/ul～10ng/ul2ulddh2oto40ul3、pcr反应微滴制备将数字pcr混合液制作成pcr微反应液滴，形成500～800万个油包水液滴。本实验的反应体系通过微滴发生器形成皮升级大小的油包水小液滴，将dna分子混合物分散到上百万个的微滴中，每个反应室平均含有一个或零个目标分子。将微滴发生板放入8通道微滴生成器中，用raindance公司生产的微滴生成器raindropsource对样本进行微滴化处理。4、pcr扩增采用博日公司的pcr扩增仪对生成的微滴进行pcr扩增。反应程序如下：预变性阶段的条件94℃，8min；1个循环；94℃10s，52℃10s，36个循环；94℃，8min,1个循环；12℃20min，1个循环；4℃，保温。5、微滴检测pcr反应结束后，将8联管置于微滴分析仪中，用raindance公司生产的微滴分析仪raindropsense对每个微滴的荧光信号进行分析含有荧光信号的微滴标记为1，不含荧光信号标记为0，再对微滴计数，软件自动分析。由于数字pcr是一种终端分析法，若目标分子没有很好地离散化，如一些微滴包含多个目标核酸分子，那么理论上得到的结果将不准确，因此引入泊松概率分布函数用以分析数据。泊松分布公式如下：根据微滴总数、含有荧光信号的微滴数及样本的稀释系数，可得到样本的ctdna水平及相应的n-ras基因突变的丰度。样本的ctdna水平表示每毫升血浆中等位基因的拷贝数，基因突变丰度表示外周血基因组中n-ras基因的突变拷贝数，突变包括第12、13和61密码子的突变。对比例1为了提高检测的灵敏度，本发明的技术人员进行了对比实验，本对比例的检测试剂盒，其余部分与实施例1相同，不同之处在于：1)引物探针设计采用常规的引物探针设计原则，设计引物长度为18～25bp,探针长度为20～30bp,产物长度为80～150bp，并且探针并未进行lna修饰，引物探针序列如表4所示。表4常规引物探针序列表位置检测类别sequence(5’—3’)12密码子上游引物attctctagtcactttaagaac12密码子下游引物agatcaggtcagcgggctaccag12s探针aactggtggtggttggagcaagtgg12d探针baactggtggtggttggagcagat13密码子上游引物btggaaggtcacactagggtt13密码子下游引物btatgggtaaagatgatccgag13r探针cgtggtggttggagcaggtagtg13a探针dtggtggtggttggagcaggtcg16密码子上游引物cttaccctccacacccccaggat16密码子下游引物ctattgatggcaaatacacagaggq61k探针ecatactggatacagctggagaagq61l探针fcatactggatacagctggaaaagq61p探针gcatactggatacagctggacgagq61r探针hcatactggatacagctggactag2)样本提取步骤中未加入组蛋白脱乙酰化酶稀释液。3)pcr扩增程序为：预变性阶段的条件95℃，10min；1个循环；94℃10s，52℃15s，60℃45s，36个循环；98℃，10min,1个循环；12℃30min，1个循环；4℃，保温。取50例样本分别采用实施例1和对比例1的试剂盒进行检测，50例样本的n-ras基因突变的丰度如表5和表6所示。表5对比例1检测50例的n-ras基因突变丰度表(％)表6实施例1检测50例的n-ras基因突变丰度表(％)结果显示，采用对比例1的试剂盒的阳性检出率为6％，n-ras基因突变的丰度的平均值为1.4％；采用实施例1的试剂盒的阳性检出率为12％，n-ras基因突变的丰度的平均值为7.1％。对比例2为了优化本对比例的检测试剂盒，其余部分与实施例1相同，不同之处在于：1)探针均没有进行lna的修饰。2)使用时分离后的血浆或者抽提后的dna样本中加入组蛋白脱乙酰化酶(sir2酶)。取20例n-ras基因突变的阳性样本，取20例样本分别采用实施例1和对比例2的试剂盒进行检测，20例样本的n-ras基因突变的丰度如表7和表8所示。表7对比例2检测20例的n-ras基因突变的丰度表(％)表8实施例1检测20例的n-ras基因突变的丰度表(％)由于使用时分离后的血浆或者抽提后的dna样本中加入了组蛋白脱乙酰化酶(sir2酶)，实施例1的样本血清中的ctdna浓度比对比例2的高5～10ng/ul。实施例1的n-ras基因突变的丰度比对比例2的n-ras基因突变丰度的平均值高4.8％。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。sequencelisting<110>上海赛安生物医药科技有限公司<120>n-ras基因突变检测引物探针及其试剂盒<130>无<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>17<212>dna<213>人工合成<400>1accctgattactggttt17<210>2<211>17<212>dna<213>人工合成<400>2tagctggattgtcagtg17<210>3<211>16<212>dna<213>人工合成<400>3gtggttggagcaagtg16<210>4<211>16<212>dna<213>人工合成<400>4gtggttggagcagatg16<210>5<211>15<212>dna<213>人工合成<400>5gtgaaatgactgagt15<210>6<211>16<212>dna<213>人工合成<400>6tctatggtgggatcat16<210>7<211>16<212>dna<213>人工合成<400>7tggttggagcaggtag16<210>8<211>16<212>dna<213>人工合成<400>8ggttggagcaggtcgt16<210>9<211>15<212>dna<213>人工合成<400>9caggattcttacaga15<210>10<211>17<212>dna<213>人工合成<400>10gtcctcatgtattggtc17<210>11<211>18<212>dna<213>人工合成<400>11tggatacagctggagaag18<210>12<211>18<212>dna<213>人工合成<400>12tggatacagctggaaaag18<210>13<211>18<212>dna<213>人工合成<400>13ctggatacagctggacga18<210>14<211>18<212>dna<213>人工合成<400>14ctggatacagctggacta18当前第1页12