本发明属于基因工程及生物医学领域，涉及一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的snp标志物及其应用。
背景技术：
唇腭裂(orofacialclefts)，是人类最常见的先天性发育缺陷之一，严重影响患者的身心健康和家庭幸福。据统计，全球每年唇腭裂的发病率约为1/700，因民族和地区而异，其中亚洲和美洲印地安人发病率为1/500，欧洲人为1/1000，而非洲人最低，约为1/2500。我国是世界上唇腭裂患者最多的国家之一，发病率高达1.42/1000，位于新生儿出生缺陷的第二位，每年还以2.5万名唇腭裂新生患儿的速度在递增，形势堪忧。
唇腭裂分两类，30％为伴有全身其他组织器官畸形的综合征型唇腭裂(syndromicorofacialclefts，soc)，70％是不伴有其他系统、器官畸形的非综合征型唇腭裂(non-syndromiccleftlipwithorwithoutcleftpalate，nscl/p)。研究证实：前者常由染色体异常、单基因突变及某些特定致畸剂所致，而后者(nscl/p)则属于复杂疾病，是遗传因素(家族连锁研究和双生子分析则证实nscl/p的遗传度达到70％)和环境因素(如孕妇早期主动或被动吸烟、饮酒、维生素缺乏、病毒感染和接触射线等)共同作用的结果。流行病学调查结果显示，个体对环境暴露因素的反应并不完全相同，例如在相同的烟草暴露下，仅有约10％吸烟妇女的后代可能会罹患唇腭裂，提示不同个体对唇腭裂具有遗传易感性。这种遗传易感性往往与个体基因组中存在的遗传变异相关。
遗传变异是指发生在dna序列的核苷酸缺失、插入、替代等变异，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snps)是最常见的变异形式。snp是指人群中出现频率大于1％的单个核苷酸的变异，人类基因组中每100-300个碱基对(basepair，bp)就存在一个snps，可能通过影响基因的表达或相关生物学功能，进而导致个体对疾病易感性的差异。以snps为遗传标记寻找复杂疾病(包括nscl/p)的遗传易感因素是揭示疾病病因，阐明疾病发病机制的重要途径之一。
近年来，微小rna(microrna，mirna)作为生物体内一种新的调控模式越来越被重视。它们属于非编码rna家族成员，是一类18-25个核苷酸的调控小rna分子。国内外研究表明mirna在小鼠胚胎发育时期的颅颌面组织中广泛表达，参与调控面部胚胎发育的一系列关键事件，包括细胞的增殖、分化、凋亡、迁移以及上皮间充质转化等过程。研究发现mirna基因snps可以通过影响mirna自身表达或与靶基因的结合能力，介导基因的调控，参与多种生理和病理过程。mirna与nscl/p发生密切相关，其snps可能会影响个体罹患nscl/p的易感性。
技术实现要素：
针对上述技术问题，发明人发现了rs2910164位点g等位基因与非综合征型唇腭裂的相关性，并据此开发了其在非综合征型唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之一是提出一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的snp标志物。
本发明的目的之二是提供检测上述snp标志物的特异性引物对。
本发明的目的之三是提供上述snp标志物在制备非综合征型唇腭裂诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之四是提供上述特异性引物对在制备非综合征型唇腭裂诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之五是提供非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒。
发明人通过提供一组与非综合征型唇腭裂高度相关的高特异性和敏感性的snp，并研制出可便于临床应用的非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒，为非综合征型唇腭裂的筛查和诊断提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的snp标志物rs2910164。
本发明提供的用于诊断非综合征型唇腭裂易感性的位点rs2910164，存在g/c多态性，当其基因型为gg时，判断个体为唇腭裂易感性个体。
本发明还提供了用于检测snp位点基因型的试剂，所述试剂可以是采用本领域已知的任何技术检测snp的试剂，只要其能够检测样本中rs2910164位点基因型即可。
本发明提供了一种检测rs2910164位点的方法，所述检测方法步骤如下：
(1)提取基因组dna；
(2)使用taqman检测法检测rs2910164位点基因型。
本发明还提供检测所述snp标志物的特异性引物对：正向引物序列如seqidno.1所示；反向引物序列如seqidno.2所示。
本发明还提供检测所述snp标志物的探针：探针fam序列如seqidno.3所示，探针vic序列如seqidno.4所示。
所述snp标志物对在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
所述snp标志物的特异性引物对在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
所述snp标志物的探针在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
一种非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血dna中的rs2910164。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有上述snp标志物的特异性扩增引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有上述snp标志物的探针。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括dna提取常用试剂，如苯酚、氯仿、异戊醇或乙醇等。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的诊断试剂盒包括：使用taqman检测snp位点基因型所需的试剂包括用于扩增snp位点在内的核苷酸序列的引物，如下表所示：探针fam为5’-tcagacctgtgaaatt-3’，探针vic为5’-tcagacctctgaaatt-3’，正向引物为5’-gaactgaattccatgggttgtgt-3’，反向引物为5’-gcccacgatgacagagatatcc-3’。
本发明提供的snp标志物作为非综合征型唇腭裂辅助诊断的标志物的优越性在于：
(1)snp是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性；
(2)snp试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于非综合征型唇腭裂的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持；
(3)通过snp生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得非综合征型唇腭裂的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1表示taqman基因分型；其中：
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1.研究样本的选择(均为中国汉族)
发明人从徐州市第一医院、南京市儿童医院和南京医科大学附属口腔医院收集了诊断明确的无家族史散发型非综合征型唇腭裂患者1406例和无唇腭裂家族史的健康对照1578例。所有研究对象均签署知情同意书(18岁以下者，由其监护人代签)，完成相应流行病学调查，并提供1-3ml外周血标本。
2.基因组dna提取
采用酚-氯仿法抽提基因组dna，经75％乙醇沉淀后得到基因组dna，dna沉淀经te溶解测定浓度后，稀释分装存入-20℃冰箱保存备用。
具体步骤：
(1)取3-5ml用edta抗凝的储存冻血，于室温下解冻，后加入4-5ml溶血试剂。移入15ml研磨器中研磨8-10min，然后移入到15ml离心管中；4,000rpm，离心10min；
(2)弃上清，加入8-10ml的溶血试剂，使用一次性滴管将沉淀吹打均匀；4,000rpm，离心10min，直至无明显红色；
(3)弃上清，在沉淀中加1ml溶血试剂，使用微量移液器将沉淀吹打均匀，完全转移至2ml的ep管中，6,000rpm，离心10min；
(4)弃上清，加入1ml细胞裂解液，将沉淀吹打均匀；(释放dna)
(5)每份样本中分别加10-20μl蛋白酶k(20mg/ml)，轻柔上下颠倒混匀10次，37℃恒温水浴过夜或56℃水浴3h。(蛋白酶k提前10min溶解；水浴过程中最好每隔1h上下颠倒混匀一次以充分反应)；
(6)水浴结束，在通风橱中，每管中加入1ml(等体积)平衡酚，上下颠倒混匀50次后，6,000rpm，离心10min。离心结束后吸取上清于另一2mlep管。(水相含有dna，白色絮状物为蛋白)；
(7)重复上述操作(6)；
(8)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀50次，6,000rpm，离心10min；
(9)吸取上清于另一1.5mlep管，加入100μl3mnaac(ph＝5)，轻轻混匀后，加入等体积预冷的异戊醇，轻柔上下颠倒混匀150次，混匀时动作要轻柔，混匀结束后可见白色的絮状物，10,000rpm，离心5min；(异戊醇提前1h放入-20℃冰箱预冷)
(10)去上清，加入350-500μl无水乙醇，轻轻振洗，10,000rpm，离心5min，(如在去除酒精的时候，dna沉淀有悬浮，可以加大离心的转速)，去酒精，把ep管放置在通风橱中风干；(一般约2h即可，若没有完全风干，可以适当延长时间)
(11)加入te100μl，4℃冰箱保存10d后，使用紫外分光计检测dna的浓度和纯度，依据所测浓度稀释分装，分装完成后将三种液体(原液即母液、次级母液、使用液)置于-20℃冰箱中保存备用。
3.本研究在1406例唇腭裂病例和1578例对照中采用taqman方法进行基因分型。
taqman等位基因分型技术是美国abi公司研发的snp分型技术，是目前较为公认的基因分型的标准之一。主要原理在pcr反应时加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因，探针的5′端标记有报告基团，为fam、vic，3′端标记有荧光淬灭基团。当探针序列完整的时候，报告荧光基团被淬灭荧光基团抑制而无信号发出。随着pcr的进行，只有一条探针能特异性地与相应的模板结合，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此可以根据检测到的不同荧光，可以判断相应样本的snp等位基因型。
3.1反应及质量控制
3.1.1采用
3.1.2探针与引物
探针及引物由南京骥骜生物公司合成。探针fam为5’-tcagacctgtgaaatt-3’，探针vic为5’-tcagacctctgaaatt-3’，正向引物为5’-gaactgaattccatgggttgtgt-3’，反向引物为5’-gcccacgatgacagagatatcc-3’。
3.1.3taqmanreal-timepcr反应体系如表1所示：
表1taqmanreal-timepcr反应体系
3.1.4abi
实验程序：50℃，2min仪器启动预热；95℃，10min使dna聚合酶活化；95℃，15sec使dna变性，60℃，60sec使引物和探针退火及延伸，共40个循环。
扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用sds2.0软件进行基因型判读，分型结果如图1(其中：
4.结果
根据检测结果，病例组分型成功率为99.7％(1402/1406)，对照组分型成功率为99.4％(1569/1578)。对照组样本中基因型cc、gc、gg基因型分布情况为35.69％、47.80％和16.51％，三种基因型的分布情况符合hwe(p＝0.768)。病例组中基因型cc、gc、gg基因型分布情况为31.38％、48.50％和20.12％，与对照组的基因型分布存在显著统计学差异(p<0.001)(表2)。其中纯合突变型gg(or＝1.39，95％ci＝1.12-1.71)能显著增加nsoc的易感性。相加模型分析显示g等位基因显著提高了罹患nsoc的风险，or＝1.17，95％ci＝1.06-1.30。根据显性遗传模型发现，gc/gg基因型与cc基因型相比，提高了nsoc易感性(or＝1.21，95％ci＝1.04-1.41)。而隐性遗传模型表明，gg基因型与gc/cc基因型相比，也能提高nsoc的患病风险(or＝1.27，95％ci＝1.06-1.53)。
我们根据nsoc不同的临床亚型进行了分层分析。相加模型分析发现rs2910164与唇裂伴/不伴腭裂以及单纯腭裂的易感性存在关联(唇裂伴/不伴腭裂：or＝1.15，95％ci＝1.03-1.28；单纯腭裂：or＝1.32，95％ci＝1.08-1.63)。从而证实位点rs2910164突变能够显著增加中国汉族人群唇裂伴/不伴腭裂以及单纯腭裂的患病风险，该位点的检测可用于对个体罹患唇裂伴/不伴腭裂以及单纯腭裂风险的预测。
表2rs2910164与非综合征型唇腭裂及其亚型的关联研究
aor，比值比；ci，可信区间。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明一个方面的例子。在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>南京医科大学附属口腔医院
<120>一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的snp标志物及其应用
<130>2017
<160>4
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>1
gaactgaattccatgggttgtgt23
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>2
gcccacgatgacagagatatcc22
<210>3
<211>16
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>3
tcagacctgtgaaatt16
<210>4
<211>16
<212>dna
<213>人工合成序列
<400>4
tcagacctctgaaatt16