本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及猪背膘厚性状的分子标记及其应用。本发明包括与猪背膘厚性状相关的acoxl和lmna基因变异位点的发现、检测方法及其在猪背膘厚性状中的应用。
背景技术：
近年来，引进的种猪包括杜洛克、长白和大白占据了我国瘦肉猪市场，对于引进品种仍需要不断进行测定和选种，才能保持其优良特性不退化。生长性状和胴体性状一直是育种改良的目标性状，对于生长和胴体性状除了采取经典的blup育种方法进行改良外，近些年通过分子标记辅助选择实施早期选择也取得了一些进展。基于全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,gwas)的结果筛选候选基因，然后在不同的群体中验证其效应，为在不同群体中寻找有效的分子标记，实施分子标记辅助选择奠定基础。
背膘厚作为一个重要的胴体性状，与猪瘦肉率呈负相关，且遗传力高，又易于度量等特点，因此常被作为瘦肉率改良的一个间接性状被用于瘦肉猪的遗传改良中。同时探讨猪产肉性状的遗传基础,降低bft也成为猪胴体性状遗传改良的研究重点。根据加拿大生猪改良中心(ccsi)的数据，从1994年到2014年中，100kg体重时的bft在1994年为13.6mm，2014年为10.6mm，总共变薄了22％，年遗传进展为-0.2毫米/年；100kg体重日龄在1994年为166天，在2014年为147天，总共缩短了12％，年遗传进展为-1天/年。
类酰基辅酶a氧化酶基因(acyl-coenzymeaoxidase-like，acoxl)编码类酰基辅酶a氧化酶，是酰基辅酶a氧化酶家族成员之一，最早是cooper等于1969年在蓖麻籽胚乳中发现蛋白(coopert,beeversh.βoxidationinglyoxysomesfromcastorbeanendosperm.journalofbiologicalchemistry.1969,244:3514-3520)。sandra等人研究非裔美国人的ii型糖尿病时，通过全基因组扫描ii型糖尿病5个染色体区域的易感基因发现acoxl可能是一个ii型糖尿病关联的候选基因，并且acoxl参与脂类代谢(hasstedtsj,highlandhm,elbeinsc,haniscl,dassk.fivelinkageregionseachharbormultipletype2diabetesgenesintheafricanamericansubsetofthegennidstudy.journalofhumangenetics.2013,58:378-383)。suneel等用1433头大白猪进行全基因组关联分析，在ssc3上找到与第十肋骨处的背膘厚相关联的区域marc0085867-alga0018683，并且在该区域把acoxl作为关联背膘厚的候选基因(onterusk,gorbachdm,youngjm,garrickdj,dekkersjc,rothschildmf.wholegenomeassociationstudiesofresidualfeedintakeandrelatedtraitsinthepig.plosone.2013,8:e61756)。
lmna基因编码a型核纤层蛋白(lamina/c)，它分为lamina和laminc两个亚基，这两个亚基是由同一个转录单位编码的，但通过选择性的剪切产生2种不同的转录本，继而翻译成两种不同的亚基。prigogine等人对于oji-creer和inuit人群的研究发现，lmna的一种常见变异lmna1908c/t多态性是影响肥胖相关特征的重要因素，与代谢综合征相关(prigoginec,richardp,vandenberghp,groswasserj,deconinckn.novellmnamutationpresentingasseverecongenitalmusculardystrophy.pediatricneurology.2010,43:283-286)。broers通过对pima印第安人的基因扫描发现lmna基因所在的染色体lq21-23区域异常与肥胖、糖尿病相关(broersj,ramaekersf,bonneg,yaourb,hutchisonc.nuclearlamins:laminopathiesandtheirroleinprematureageing.physiologicalreviews.2006,86:967-1008)。choi等人在韩国本地猪×长白猪产生的f2代群体研究位于ssc4的约89cm区域与脂肪沉积相关的qtl，并且在该区域比较猪和人的图谱，从而把lmna作为背膘厚的潜在候选基因(choibh,leejs,leesh,kimsc,kimsw,kimks,leejh,seonghh,kimth.porcinelmnaisapositionalcandidategeneassociatedwithgrowthandfatdeposition.asian-australasianjournalofanimalsciences.2012,25:1649)。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，克隆检测猪背膘厚性状的分子标记及其应用。根据acoxl和lmna两个基因已知序列，利用混池测序和pcr-rflp方法，寻找这两个基因中与猪第十肋骨处背膘厚性状关联的snp位点，并将snp与目标性状进行关联分析，从而获得两个与背膘厚性状关联的分子标记，为猪的标记辅助选择提供新的分子标记资源。
本发明通过以下技术方案实现：
首先利用14头大白猪和4头长白猪的重测序数据分析得到acoxl基因和lmna基因可能存在的snp位点。然后将snp所在外显子序列克隆下来，进行混池测序和pcr-rflp来酶切分型，最后获得snp。所述的acoxlc.8c/t，位于第一外显子上，碱基突变如图2所示，引起苏氨酸到异亮氨酸的改变。lmnac.741g/c，位于第四外显子上，碱基突变如图3所示，引起谷氨酸到天冬氨酸的改变。
一种猪背膘厚性状的分子标记acoxlc.8c/t，其核苷酸序列如下所示：
agggatgtactcacatcatatggaagttcccaggctaggggtcgaatcagagctgcagctgccagcctgcacaatagccacagcaatgcaggatctgagccttgtctgtgacctacaccacagttctttaacccactgagtgaagccagggatcgaacccacaacctcatggttcctagtcagatttgtttccgctgtgccaagatgggaactccctcaatcaaacatcttaacacccactttgtatccattcatcacaggtatgatttaagtctggatgaaatgagaar(c/t)ctgacacttcagagagtgaagtttaccatgggcctacctttgttaaagcgtgcaattcaggaacaggtaaggttcattgttattttggtgtgtgtgagtgaatgagagagagacagagacagagggagcaagaagatttcgttttgcttgtttttgtgacttgtggaaggaagctcatgaattttgtcctgtggtgtgggggagggcctccttcaccctccctttctgccccccccaatataattgacattcacttttcccaagcccacaggcttaggaataagggagtcaacagaggtaatgaaatatttgttcacaaaacaaatgtaatttggggtataaaatgcaaatatctgagaaatgtaatgacatcactttataggctcttcaagaattttaaacttgcccc
上述序列的290位碱基处的r是c或t(即碱基c与碱基t发生替换)，该突变引起苏氨酸至异亮氨酸的改变。
一种猪背膘厚性状的分子标记lmnac.741g/c，其核苷酸序列如下所示：
gtcagagctggggctgggacattggctgtgtgcagagctcccctgcctgactcccttgtactagtggatggggagttgggtctggggggacggggagtggccagccctcaggttaaaggggggctcacagtggctccattcgcggttaggattgggtcgggagctcagccacctgcctgggtcccatcctcagaggactagttctgattttggtttctgggtccaacccttccaggagcttcgggagaccaagcgccgccatgagacgcggctggtggagattgataatgggaagcagcgcgagtttgagagccggccggctggcagatgccctgcaggar(g/c)
tgcgggcccagcacgaggaccaggtggtgctcgctctcctgtggctccctcgctgcctctgaccctggcacccctccccccacctctgccaccctgatacgtcccttgcgggatcgggtggatgatagcaggagccccgggtgcccaggacctgaggctgcagcagagatgccgttcccaggtcccttccggcccctgcatccctaaccccgcgtcttcccctccag
上述序列的341位碱基处的r是g或c(即，由碱基g与碱基c发生替换)，该突变引起谷氨酸至天冬氨酸的改变。
申请人制备了一种扩增acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外显子序列和lmnac.741g/c所在的lmna第四外显子序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：
(1)扩增acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外显子序列(同时也是酶切时所用引物)如下：扩增片段为501bp，退火温度为61℃
正向引物：caggatctgagccttgtctgtg
反向引物：cctctgttgactcccttattccta
(2)扩增lmnac.741g/c所在lmna第四外显子序列的引物如下：
扩增片段：855bp，退火温度：60℃
正向引物：cccctggacctgtttgtg
反向引物：cctgggaacggcatctct
(3)lmnac.741g/c在pcr-rflp时pcr所用引物如下：
扩增片段长度：441bp，退火温度：59℃
正向引物：ttctcctgaacgtgtctggattaccactgttgagagccggctggca
gatgccctgcagca
反向引物：ctgagctgggccgagaggctgtcgatg
本发明的分子标记可在猪背膘厚性状检测中应用
附图说明
图1：是本发明的技术流程图。
图2：acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外显子序列。括号内显示该等位基因的突变。
图3：acoxlc.8c/t的混池测序的结果。
图4：acoxlc.8c/t的酶切分型胶图。
图5：lmnac.741g/c所在的lmna第四外显子序列。括号内显示该等位基因的突变。
图6：lmnac.741g/c的混池测序的结果。
图7：lmnac.741g/c的酶切分型胶图。
具体实施方式
实施例1
acoxl和lmna基因snps的筛选
1.引物设计
根据重测序数据分析得到的可能snp位点，设计引物将acoxl基因(geneid:100520554)第一外显子和lmna基因(geneid:100126859)第四外显子克隆出来，用于混池测序，扩增该基因的特异引物的序列如下：
扩增acoxlc.8c/t所在的acoxl第一外显子序列:
正向引物：caggatctgagccttgtctgtg
反向引物：cctctgttgactcccttattccta
扩增lmnac.741g/c所在的lmna第四外显子序列:
正向引物：cccctggacctgtttgtg
反向引物：cctgggaacggcatctct
2.pcr扩增条件
样品基因自dna从大白猪耳样和长白猪精液(样本来自湖北省武汉市华中农业大学实验猪场)提取获得(按常规方法提取基因组dna，例如采用商购的试剂盒)，用于pcr程序的dna样品均稀释成20ng/μl。引物浓度为10um，购自(武汉擎科创新生物科技有限公司)。mix为2×pcrmix，购自(北京艾德莱生物科技有限公司)，loadingbuffer自己配置(称取4.4gedta，0.25g二甲苯菁ff，0.25g溴酚蓝，溶于200mlddh2o，加热搅拌溶解。加入180mlglycerol后，用naoh调节ph7.0，ddh2o定容至500ml，-20℃保存)，为6×的浓度。
acoxlc.8c/t:10μlpcr体系，取5μl2×pcrmix，3.6μl灭菌水，取浓度为10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna样品1μl。95℃预变性5分钟，35个循环(95℃30s，61℃30s，72℃30s)，72℃延伸5分钟。所得的产物长度为501bp，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
lmnac.741g/c:10μlpcr体系，取5μl2×pcrmix，3.6μl灭菌水，取浓度为10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna样品1μl。95℃预变性5分钟，35个循环(95℃30s，60℃52s，72℃30s)，72℃延伸5分钟。所得的产物长度为855bp，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
然后随机选择10个样品，将10个样品混在一块送交测序公司测序，是为混池测序。测序结果用软件seqman查看和编辑。
3.acoxl和lmna基因pcr-rflp
(1)引物序列(设计引物用于酶切分型)
acoxlc.8c/t:
正向引物：caggatctgagccttgtctgtg
反向引物：cctctgttgactcccttattccta
lmnac.741g/c酶切时所用引物如下：
正向引物：ttctcctgaacgtgtctggattaccactgttgagagccggctggca
gatgccctgcagca
反向引物：ctgagctgggccgagaggctgtcgatg
(2)pcr扩增条件
acoxlc.8c/t：10μlpcr体系，取5μl2×pcrmix，3.6μl灭菌水，取浓度为10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna样品1μl。95℃预变性5分钟，35个循环(95℃30s，61℃30s，72℃30s)，72℃延伸5分钟。所扩得产物长度为501bp。用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
lmnac.741g/c：10μlpcr体系，取5μl2×pcrmix，3.6μl灭菌水，取浓度为10umpf和pr0.2μl，取50ng/μl的dna样品1μl。95℃预变性5分钟，35个循环(95℃30s，59℃30s，72℃30s)，72℃延伸5分钟。所扩得产物长度为441bp。用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)pcr-rflp检测条件
酶切体系：10μl体系，内切酶取0.1μl，10×buffer取1μl，灭菌水取3.9μl，pcr产物取5μl。样品混合离心后，在37℃培养箱中过夜酶切(约12h)。酶切后取5μl产物在1.8％的琼脂糖凝胶低压长时间电泳(105v，1h)
acoxlc.8c/t三种基因型：cc型(501bp)，ct型(501bp，300bp，201bp)，tt型(300bp，201bp)。所用内切酶为ecori。
lmnac.741g/c三种基因型：cc型(331bp，110bp)，cg型(331bp，271bp，110bp，60bp)，gg型(271bp，110bp，60bp)。所用内切酶为pvuii。
(4)分子标记与目标性状的关联分析
试验以369头大白猪和157头长白猪为研究对象。利用混合线性模型
表1大白猪acoxl基因c.8c/t位点与3个性状关联结果
表1的说明：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；note：*meanp＜0.05，**meanp＜0.01。
lmnac.741g/c在大白猪和长白猪中均与背膘厚显著关联(p＜0.05)。其中在大白猪中，cc型有90个个体，cg型有184个个体，gg型有76个个体。cc型与cg型和gg型差异显著(p＜0.05)，cc型是优势基因型。在长白猪中，cc型有90个个体，cg型有43个个体，gg型有8个个体。cc型与cg型和gg型差异显著(p＜0.05)，cg型是优势基因型。
表2大白猪lmna基因c.741g/c位点与3个性状关联结果
表2的说明：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；note：*meanp＜0.05，**meanp＜0.01。
表3长白猪lmna基因c.741g/c位点与3个性状关联结果
表3的说明：*表示p＜0.05，**表示p＜0.01；note：*meanp0.05，**meanp＜0.01。