本发明属于生物多肽提取
技术领域：
，具体涉及一种富含脯氨酸多肽的初乳肽及其制备方法。
背景技术：
：富含脯氨酸的蛋白质(proline-rich-proteins，prps)代表一类富含脯氨酸和羟基脯氨酸的结构蛋白，广泛存在于双子叶植物和单子叶植物中。富脯氨酸类蛋白种类繁多，结构的多样性决定了功能的多样性，但是国内对于他们的研究甚少。1974年，波兰科学家janusz等在纯化羊初乳igg时，发现了一种不能同时被抗免疫球蛋白的抗血清所沉淀的物质脯氨酸多肽(prp)，富脯氨酸多肽(prp)是一种免疫活性物质，含有大量的脯氨酸和疏水性氨基酸的多肽，存在于动物的血液和哺乳动物的初乳之中，在4℃条件下可溶于水，室温下发生可逆性沉淀，具有调节人体免疫反应，增强皮肤脉管的渗透性，对阿尔茨海默病具有很好的预防及治疗作用，同时能够刺激未成熟的胸腺细胞转化为具有功能活性的t-细胞，能抑制过分活跃的或激活不活跃的免疫系统。牛初乳是富脯氨酸多肽的重要来源之一，但现今许多牛初乳生产商在加工过滤过程中，过滤了富脯氨酸多肽，导致富脯氨酸多肽损失量大，不仅降低生产厂家的经济效益，而且将其作为废弃物增加厂家处理成本。近年，英美国家对于初乳来源的富含脯氨酸多肽的研究开始渐热，但其领域主要针对脯氨酸多肽(prp)糜蛋白酶水解物某些片段的生物活性功能，尤其是在抗氧化、抗衰老、抗神经退行性病变的功效，而对于prp的纯化鉴定相对较少。目前获得富脯氨酸多肽的方法大多数是通过化学合成和基因工程获得的，少数通过从牛初乳中提取获得的，具体的，如中国专利cn200980128153.1公开了用作精神刺激剂的衍生自由proll基因编码的人碱性富脯氨酸泪蛋白(bplp)的肽，其是经过基因编码获得，非牛初乳天然来源；中国专利cn200580015689.4公开了bplp蛋白所衍生的作为新的金属外肽酶抑制剂的肽，及其编码所用的多核苷酸，以及其抗体的诊断性和治疗性用途。该bplp也是经过基因编码，非牛初乳天然来源；中国专利cn201310726948.0公开了一种小麦富脯氨酸类蛋白tazmh122及其编码基因和应用，该小麦富脯氨酸类蛋白经过基因编码获得，非以牛初乳天然来源获得的；以及商业化的产品：colostrinin、memoryaid、cognisure、cognate、cognase、dyna，由此可见，虽然化学合成和基因工程制备的富含脯氨酸多肽含量高，活性好，但是其成本高、制备工艺复杂、周期长。现有报道按两步法(乙醇提取法、硫酸铵沉淀法)从牛初乳中制备富含脯氨酸多肽，其大小为0.5-3kda组成的32肽以上混合物，但其制备方法不适用于工业化生产。综上所述，提供一种适用于工业化的以牛初乳为原料提取富含脯氨酸多肽的初乳肽具有重要意义。技术实现要素：鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，实现了从牛初乳中分离纯化富含脯氨酸多肽的初乳肽工业化生产，提高了牛初乳生产商的经济效益，降低厂家的废弃物处理成本。本发明的另一个目的是提出一种富含脯氨酸多肽的初乳肽，纯度高，脯氨酸的含量占主要部分，脯氨酸含量约占27％，且产率较高。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，包括以下步骤：s1.备取牛初乳：收集健康的母牛在分娩后72小时内的产乳，即得牛初乳；s2.将牛初乳离心脱脂，得脱脂乳；s3.将脱脂乳分离酪蛋白后微虑除菌或直接将脱脂乳进行微虑除菌，调节ph，加蛋白酶，进行酶解得酶解产物；s4.将酶解产物在2-5℃下加铵盐沉淀、加压凝析得凝析产物；s5.将凝析产物加水溶解、超滤浓缩得浓缩液；s6.将浓缩液冷冻干燥，即得。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s2中所述离心条件为温度40℃～45℃，转速5500rpm～6000rpm。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s3中所述分离酪蛋白的具体步骤为：将脱脂乳用酸调节ph至4.2-4.6，38-42℃保温25-35min、2500r/min、0.4mpa离心，得澄清乳清。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s3中所述微虑除菌选用孔径0.45μm的陶瓷膜；所述ph调节剂为4000目氢氧化钙，所述ph为8.0～8.2；所述酶解时间为11-13小时。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s4中所述铵盐选用40-70％饱和硫酸铵盐。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s4中所述凝析时间为7-9小时。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s5中所述凝析产物与所述水的用量比为1kg∶(0.8-1.2)l，溶解时间为4～12小时，温度为12～28℃。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s5中所述超滤浓缩选用mwco陶膜，所述mwco陶膜的孔径为10～50kda，流速为3～5m/s，压力为0.3～0.5mpa。上述的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽的制备方法，其中，步骤s6中所述冷冻温度为-50--60℃，冻干时间为4.5-6小时。一种根据上述的制备方法制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽。与现有技术相比，本发明提供的一种富含脯氨酸多肽的初乳肽及其制备方法，达到的技术效果是：1.本发明实现了从牛初乳中分离纯化富含脯氨酸多肽的初乳肽工业化生产；2.本发明以牛初乳为来源提取富脯氨酸多肽，提高了牛初乳生产商的经济效益，降低厂家的废弃物处理成本；3.本发明的制备方法操作步骤简单，适于工业化生产，而且在提取富脯氨酸多肽的过程中，厂家可以按照各自意愿选择性的分离酪蛋白，进一步减少成本，增加厂家的收入来源；4.本发明的制备方法脱脂步骤是由于牛初乳中的脂肪中含有激素，抗生素等不利于健康的残留物，脂肪容易腐败和微生物滋生，残留会影响乳制品的有效期；5.本发明中加入氢氧化钙的目的不仅具有调节ph作用，而且作为酶活性剂降低酶解时间；6.本发明的制备方法层层递进，以及各参数的科学选择使得制备得到富含脯氨酸多肽的初乳肽，脯氨酸的含量占主要部分，脯氨酸含量约占27％，且产率较高；7.本发明制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽具有增强免疫活性的作用，尤其具有增强nk细胞活性作用。以下便结合实施例及附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。附图说明图1是实施例6中富含脯氨酸多肽的初乳肽的sds-page电泳图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。实施例1备取牛初乳：收集健康的母牛在分娩后72小时内的产乳，即得牛初乳；脱脂：取上述备取的牛初乳100kg置于连续碟式离心机中分离，温度40℃，转速5500rpm，离心后得脱脂乳80kg；分离酪蛋白：将脱脂后得到的脱脂乳用浓度为10％醋酸调节ph至4.5，40℃保温30min，置于连续碟片式离心机中分离，电流30a，转速：2500r/min，压力：0.4mpa，得澄清乳清，得酪蛋白约为8kg；除菌：将上述澄清乳清选用法国tami公司生产的1号陶瓷膜过滤系统，陶瓷膜孔径0.45μm，进行微滤除菌，压力0.25mpa，温度35℃，流速为4m/s，得除菌液约70kg；酶解：将上述除菌液70kg移入100l带螺杆的玻璃保温桶中，恒温至37℃，加入300g4000目氢氧化钙，调节ph至8.0，加入糜蛋白酶100g(酶活力1000iu/mg)，并开启搅拌器慢速搅拌，酶解时间为12小时，得酶解产物；凝析：将酶解产物降温至4℃，恒温后加入50％饱和硫酸铵盐，压力为0.3mpa，凝析8小时后过滤，得沉淀物即凝析产物约24kg；精萃：将所得凝析产物24kg加入注射用水24l，并用搅拌杆轻轻搅拌促其溶解，溶解时间约为6小时，温度恒温20℃，得溶解液48kg；超滤浓缩：将上述溶解液48kg采用孔径为30kda的mwco陶膜进行超滤浓缩，流速为3m/s，压力为0.3mpa，温度为20℃，得浓缩液40kg；低温冻干：将上述浓缩液采用glzy真空冷冻干燥机温度：-55℃，真空度110kg条件下冻干5小时，即得本发明所述富含脯氨酸多肽的初乳肽15kg，得率为15％。实施例2备取牛初乳：收集健康的母牛在分娩后68小时的产乳，即得牛初乳；脱脂：取上述备取的牛初乳100kg置于连续碟式离心机中分离，温度45℃，转速6000rpm，离心后得脱脂乳81kg；分离酪蛋白：将脱脂后得到的脱脂乳用浓度为10％醋酸调节ph至4.2，38℃保温25min，置于连续碟片式离心机中分离，电流30a，转速：2500r/min，压力：0.4mpa，得澄清乳清，得酪蛋白约为8.2kg；除菌：将上述澄清乳清选用法国tami公司生产的1号陶瓷膜过滤系统，陶瓷膜孔径0.45μm，进行微滤除菌，压力0.25mpa，温度38℃，流速为5m/s，得除菌液约71kg；酶解：将上述除菌液71kg移入100l带螺杆的玻璃保温桶中，恒温至37℃，加入310g4000目氢氧化钙，调节ph至8.2，加入糜蛋白酶100g(酶活力1000iu/mg)，并开启搅拌器慢速搅拌，酶解时间为11小时，得酶解产物；凝析：将酶解产物降温至4℃，恒温后加入50％饱和硫酸铵盐，压力为0.5mpa，凝析8小时后过滤，得沉淀物即凝析产物约25kg；精萃：将所得凝析产物25kg加入注射用水25l，并用搅拌杆轻轻搅拌促其溶解，溶解时间约为10小时，温度恒温12℃，得溶解液49kg；超滤浓缩：将上述溶解液49kg采用孔径为30kda的mwco陶膜进行超滤浓缩，流速为5m/s，压力为0.5mpa，温度为20℃，得浓缩液41kg；低温冻干：将上述浓缩液采用glzy真空冷冻干燥机温度：-55℃，真空度110kg条件下冻干5小时，即得本发明所述富含脯氨酸多肽的初乳肽15.8kg，得率为15.9％。实施例3备取牛初乳：收集健康的母牛在分娩后24小时的产乳，即得牛初乳；脱脂：取上述备取的牛初乳100kg置于连续碟式离心机中分离，温度42℃，转速5800rpm，离心后得脱脂乳85kg；分离酪蛋白：将脱脂后得到的脱脂乳用浓度为10％醋酸调节ph至4.5，38℃保温25min，置于连续碟片式离心机中分离，电流30a，转速：2500r/min，压力：0.4mpa，得澄清乳清，得酪蛋白约为8.5kg；除菌：将上述澄清乳清选用法国tami公司生产的1号陶瓷膜过滤系统，陶瓷膜孔径0.45μm，进行微滤除菌，压力0.25mpa，温度35℃，流速为4m/s，得除菌液约76kg；酶解：将上述除菌液76kg移入100l带螺杆的玻璃保温桶中，恒温至37℃，加入35094000目氢氧化钙，调节ph至8.0，加入糜蛋白酶110g(酶活力1000iu/mg)，并开启搅拌器慢速搅拌，酶解时间为12小时，得酶解产物；凝析：将酶解产物降温至4℃，恒温后加入40％饱和硫酸铵盐，压力为0.4mpa，凝析7小时后过滤，得沉淀物即凝析产物约27kg；精萃：将所得凝析产物27kg加入注射用水27l，并用搅拌杆轻轻搅拌促其溶解，溶解时间约为10小时，温度恒温25℃，得溶解液54kg；超滤浓缩：将上述溶解液54kg采用孔径为30kda的mwco陶膜进行超滤浓缩，流速为3m/s，压力为0.3mpa，温度为20℃，得浓缩液45kg；低温冻干：将上述浓缩液采用glzy真空冷冻干燥机温度：-55℃，真空度110kg条件下冻干5小时，即得本发明所述富含脯氨酸多肽的初乳肽16.9kg，得率为17％。实施例4本发明初乳中不分离酪蛋白并获得初乳肽工业制法如下：备取牛初乳：收集健康的母牛在分娩后72小时内的产乳，即得牛初乳；脱脂：取上述备取的牛初乳100kg置于连续碟式离心机中分离，温度40℃，转速5500rpm，离心后得到脱脂乳；得80kg。除菌：将上述脱脂乳选用法国tami公司生产的1号陶瓷膜过滤系统，陶瓷膜孔径0.45μm，进行微滤除菌，压力0.25mpa，温度35℃，流速为4m/s，得除菌液约80kg；酶解：将上述除菌液移入100l带螺杆的玻璃保温桶中，恒温至37℃，加入300g4000目氢氧化钙，调节ph至8.0，加入糜蛋白酶111g(酶活力1000iu/mg)，并开启搅拌器慢速搅拌，酶解时间为12小时，得酶解产物；凝析：将酶解产物降温至4℃，恒温后加入50％饱和硫酸铵盐，压力为0.3mpa，凝析8小时后过滤，得沉淀物即凝析产物约35kg；精萃：将所得凝析产物35kg加入注射用水35l，并用搅拌杆轻轻搅拌促其溶解，溶解时间约为6小时，温度恒温20℃，得溶解液70kg。超滤浓缩：将上述溶解液采用30kda的mwco陶膜进行超滤浓缩，流速为3～5m/s，压力为0.3～0.5mpa，温度为20℃，得浓缩液55kg；低温冻干：将上述浓缩液采用glzy真空冷冻干燥机温度：-55℃，真空度110kg条件下冻干5小时，即得本发明所述富含脯氨酸多肽的初乳肽25kg，得率为25％。实施例5初乳肽氨基酸组成分析称取实施例4制备的初乳肽2mg放入玻璃管中，加入2ml，6mol/lhcl，充氮气5min，封管。将玻璃管放在80℃恒温干燥箱内水解24h。水解结束后冷却至室温，定容至10ml过滤，取2ml滤液置真空干燥器中55℃左右抽真空干燥，加入纯水2ml溶解。加入0.1mmol/lnaoh，调节ph值至1.7～2.2，0.22μm滤膜过滤，转入样品瓶待测。用全自动氨基酸分析仪进行氨基酸组成的分析。表1初乳肽的氨基酸组成分析氨基酸比例(％)氨基酸比例(％)asp4.55ile3.05thr4.4leu8.3ser7.05tyr2.05glu12.15phe4.45gly2.8lys4.85ala3.5his2.8cys0.2ary1.6val7.75pro26.85met2.65由表1可知，实施例4制备的初乳肽中包含17种氨基酸，其中，脯氨酸的含量占主要部分，脯氨酸含量为26.85％。实施例6富含脯氨酸多肽的初乳肽分子量测定蛋白质分子质量测定常规方法包括sds-page和凝胶色谱技术，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)查看分子量。浓缩胶：电压为120v，电流为20ma，时间为30min，等溴酚蓝走过浓缩胶后，样品被浓缩成一条线；分离胶：电压为220v，电流为40ma，时间为40min。待溴酚蓝指示距板底部3mm时，停止电泳。在胶上做上标记，去掉浓缩胶，胶片落入染色液中，将染色缸放在摇床上慢慢摇动固定30min，再次更换染色液染色1h，接着使用脱色液脱至透明(脱色3次，第1次1h，第2次1h，第3次30min)，至能看出清晰的蛋白带。将实施例1和实施例4进行检测，如图1：实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽的sds-page电泳图；经图得知，回归方程式：y＝10.063x-0.1867；r2＝0.9954，具有良好的线性关系。初乳肽中主要分为三个质量片段，第一为5500da，第二为：1500～4000da，第三为：1000～1500da。实施例7富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠急毒试验选取健康icr小鼠20只，雌雄各半，体重18-22g，剂量设计为21500mg/kgb.w.，称取实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽21500mg，加双蒸水至40ml配制成受试物，小鼠禁食过夜后，24小时内分2次灌胃，每次灌胃20ml/kgb.wt，末次灌胃后4小时给食，自由摄食，观察14天，结果见表2、3。表2实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠体重的影响由表2得知，实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠体重增长无影响。表3实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠急毒观察情况由表3得知，实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽经小鼠灌胃后未见明显中毒表现，观察期内无动物死亡。实施例8富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠长毒试验选取4周龄健康sd大鼠，雌雄各40只，进室适应4日，选取体重为70～100个按性别随机分组，每组10只，单笼饲养。按13.3mg/kgb.w.设置0、667、1333和2000mg/kgb.w/d.各4个剂量组，分别称取实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽0、667、1333、2000mg拌入饲料至100g，以每日100g/kgb.w.摄食。观察小鼠试验期内生长发育情况，结果见表4。表4实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽对大鼠生长发育的影响由表4可知，各个剂量组对大鼠体重与对照组值相比，均无显著性差异(p＞0.05)。实施例9富含脯氨酸多肽的初乳肽的功能性试验选取健康icr小鼠20只，雌雄各半，雌雄各40只，进室适应4日，选取体重为18～22g随机分组，每组10只，单笼饲养。按13.3mg/kgb.w.设置0、667、1333和2000mg/kgb.w/d.各4个剂量组，分别称取实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽0、667、1333、2000mg拌入饲料至100g，以每日100g/kgb.w.摄食，30天后观察小鼠试验期内单核巨噬细胞功能试验及nk细胞活性试验，见表5，表6。表5小鼠-单核巨噬细胞功能试验实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽各剂量组与对照组小鼠吞噬率与吞噬指数经anona分析得p值＞0.05。表6小鼠-nk细胞活性功能试验实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽各剂量组小鼠nk细胞活性均高于对照组，经方差分析及两两比较统计学处理，中、低剂量组有统计学意义(p＜0.05，p＜0.01)。表明实施例4制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠具有增强nk细胞活性的作用。综上所述，经实施例6-9的试验证明，本发明制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽分子量在1500～4000da；通过急毒和长毒药理实验得知本发明制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽安全，无毒副作用；通过功能性试验证明本发明制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽对小鼠具有增强nk细胞药理活性的作用。其中，实施例1-3制备的富含脯氨酸多肽的初乳肽同样经过初乳肽氨基酸组成分析、蛋白质分子质量测定、小鼠急毒试验、小鼠长毒试验和功能性试验，其结果与实施例4的结果相似。对比例1备取牛初乳：收集健康的母牛在分娩后72小时内的产乳，即得牛初乳；脱脂：取上述备取的牛初乳100kg置于连续碟式离心机中分离，温度40℃，转速5500rpm，离心后得到脱脂乳；得80kg。除菌：将上述脱脂乳选用法国tami公司生产的1号陶瓷膜过滤系统，陶瓷膜孔径0.45μm，进行微滤除菌，压力0.25mpa，温度35℃，流速为4m/s，得除菌液约80kg；酶解：将上述除菌液移入100l带螺杆的玻璃保温桶中，恒温至37℃，加入氢氧化钠，调节ph至8.0，加入糜蛋白酶111g(酶活力1000iu/mg)，并开启搅拌器慢速搅拌，酶解时间为30小时，得酶解产物；凝析：将酶解产物降温至4℃，恒温后加入50％饱和硫酸铵盐，压力为0.3mpa，凝析8小时后过滤，得沉淀物即凝析产物约35kg；精萃：将所得凝析产物35kg加入注射用水35l，并用搅拌杆轻轻搅拌促其溶解，溶解时间约为6小时，温度恒温20℃，得溶解液70kg。超滤浓缩：将上述溶解液采用30kda的mwco陶膜进行超滤浓缩，流速为3～5m/s，压力为0.3～0.5mpa，温度为20℃，得浓缩液55kg；低温冻干：将上述浓缩液采用glzy真空冷冻干燥机温度：-55℃，真空度110kg条件下冻干5小时，即得本发明所述富含脯氨酸多肽的初乳肽25kg，得率为25％。由对比例1与实施例4的区别在于将4000目氢氧化钙替换为氢氧化钠，其结果表明酶解时间由12小时延长为30小时，说明本发明采用氢氧化钙的作用不仅具有调节ph的作用，而且具有作为酶活性剂减少酶解时间，提高酶解效率的作用。上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。当前第1页12