本发明涉及一种连续制备草鱼肝脏蛋白水解物的方法，属于鱼类肝脏蛋白水解物制备技术领域。
背景技术：
我国内陆水域辽阔，淡水鱼资源十分丰富。随着淡水鱼的产量不断提高，人们需求的日益增长，我国淡水鱼加工业得到一定程度的发展，但是许多加工过程仅局限在对鱼体肌肉的加工上，如生产鱼糜、鱼丸等，实际应用中对下脚料的加工利用较少，少部分作为饲料鱼粉或直接作为肥料，绝大部分被废弃，而各种下脚料中淡水鱼内脏比重大，组成复杂，带来的环境污染也是最严重的。如何深度开发淡水鱼内脏，不仅对于淡水鱼的综合利用和保护环境有重要意义，而且也能支持和促进淡水鱼捕捞和养殖产业的发展。
草鱼是我国产量最大的淡水养殖鱼种，研究表明，草鱼内脏的粗蛋白含量达6.7％～9.9％，内脏蛋白中必需氨基酸占氨基酸总量的41.56％，氨基酸组成模式比较均衡，是优质的动物蛋白来源。与现代添加外源酶水解技术的兴盛相比，人们很早就开始在不添加外源酶的条件下制取水解蛋白，水产动物体内活性很高的丰富内源酶系以及鱼体所含微生物对细胞结构和蛋白质等成分起着协同一致、缓慢而持久的分解作用，得到富含氨基酸及肽类物质的水解蛋白，具有工艺简单、成本低廉等优点。
在过去的几十年中，研究发现肽和蛋白质水解物具有良好的抗氧化能力，并有可能成为新的抗氧化剂的来源，甚至是健康食品来源。但到目前为止，未见草鱼肝脏蛋白水解物的抗氧化活性及其制备方法的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种连续制备草鱼肝脏蛋白水解物的方法，其具有工艺简单、成本低廉等优点。
本发明的技术方案，连续制备草鱼肝脏蛋白水解物的方法，步骤如下：
(1)初步处理：称取15g经过脱脂处理的草鱼内脏置于250ml锥形瓶中，加入蒸馏水调节料水比为1:20～40g/ml，室温下搅拌提取20-28h，过滤，用去离子水洗涤残渣三次，抽虑至干，得到滤液和草鱼肝脏残渣；
(2)水溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备：
a、取步骤(1)所得滤液经hac酸化至ph4.3～4.7后，添加(nh4)2so4至饱和度为60％～100％，饱和液于4℃沉淀8～12h后，3000～5000rmp离心15～25min，除去上清液，得到沉淀；
b、步骤a所得沉淀用ph8.0的tris-hcl缓冲液溶解，并在tris-hcl缓冲液中4℃透析48～72h，-40℃冷冻干燥即得水溶性草鱼肝脏蛋白水解物；
(3)盐溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备：
c、在步骤(1)所得草鱼肝脏残渣中，以料液比为1:20～40g/ml加入0.5mol/l的nacl溶液，搅拌浸提3-5h，过滤，用去离子水洗涤残渣三次，抽滤至干，得到滤液和残渣；
d、步骤c所得滤液经hac酸化至ph4.3-4.7后，添加(nh4)2so4至饱和度为40％～60％，于4℃沉淀12～24h后，3000～5000g离心15～25min，除去上清液，得到沉淀；
e、步骤d所得沉淀用ph8.0的tris-hcl缓冲液溶解，并在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，-40℃冷冻干燥即得盐溶性草鱼肝脏蛋白水解物；
(4)醇溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备：
f、在步骤c提取后所剩余的残渣中，以料液比1:20～40g/ml加入质量浓度为75％的乙醇，室温下搅拌提取3～5h，抽滤，用质量浓度为75％乙醇洗涤残渣三次，抽滤至干，得到滤液和残渣；
g、在步骤f所得滤液中加入滤液1倍量的去离子水，4℃沉淀12～24h，3000～5000rmp离心15～25min，除去上清液，得到沉淀；
h、对步骤g所得沉淀用质量浓度为75％的乙醇溶解，在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，-40℃冷冻干燥即得醇溶性草鱼肝脏蛋白水解物；
(5)碱溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备：
i、在步骤f提取后剩余的残渣中，以料液比1:20～40g/ml加入0.1mol/l的naoh溶液，室温下搅拌提取3～5h，抽滤，用质量浓度为75％的乙醇洗涤残渣三次，抽滤至干，得到滤液和残渣；
j、在步骤i所得滤液中加入滤液1倍量的去离子水，4℃沉淀12～24h，3000～5000rmp离心15～25min，除去上清液，得到沉淀；
k、步骤j所得沉淀用ph8.0的tris-hcl溶解，在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，冷冻干燥即得碱溶性草鱼肝脏蛋白水解物。
本发明的有益效果：本发明通过连续制备得到水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性草鱼肝脏蛋白水解物，其制备过程简单环保，其得率较高，适用于连续生产，为工业化生产打下了良好的基础。
附图说明
图1是实施例1-4产物抗氧化结果示意图。
具体实施方式
实施例1水溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备
称取15g经过脱脂处理的草鱼内脏置于250ml锥形瓶中，加入蒸馏水调节料水比为1:20～40g/ml，室温下搅拌提取20-28h，过滤，用少量去离子水洗涤残渣三次，抽虑至干，滤液经hac酸化至ph4.3～4.7后，添加(nh4)2so4至60％～100％，饱和液于4℃沉淀8～12h后，3000～5000g离心15～25min，除去上清液，沉淀用少量ph8.0的tris-hcl缓冲液溶解，并在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，冷冻干燥即得水溶性草鱼肝脏蛋白水解物。
实施例2盐溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备
实施例1所得的草鱼肝脏残渣中，再以料液比为1:20～40g/ml加入0.5mol/lnacl溶液，搅拌浸提3-5h，过滤，用少量去离子水洗涤残渣三次，抽滤至干，滤液经hac酸化至ph4.3-4.7后，添加(nh4)2so4至饱和度为40～60％，于4℃沉淀12～24h后，3000～5000g离心15～25min，除去上清液，沉淀用少量ph8.0的tris-hcl缓冲液溶解，并在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，冷冻干燥即得盐溶性草鱼肝脏蛋白水解物。
实施例3醇溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备
再以盐溶性草鱼肝脏蛋白提取后所剩余的残渣中，以料液比1:20～40g/ml加入75％乙醇，室温下搅拌提取3～5h，抽滤，用少量75％乙醇洗涤残渣三次，抽滤至干，滤液中加入1倍量的去离子水，4℃沉淀12～24h，3000～5000g离心15～25min，除去上清液，沉淀用少量75％乙醇溶解，在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，冷冻干燥即得醇溶性草鱼肝脏蛋白水解物；
实施例4碱溶性草鱼肝脏蛋白水解物的制备
再以醇溶性草鱼肝脏蛋白提取后剩余的残渣中，以料液比1:20～40g/ml加入0.1mol/lnaoh溶液，室温下搅拌提取3～5h，抽滤，用少量75％乙醇洗涤残渣三次，抽滤至干，滤液中加入1倍量的去离子水，4℃沉淀12～24h，3000～5000g离心15～25min，除去上清液，沉淀用少量ph8.0的tris-hcl溶解，在tris-hcl缓冲液中，4℃透析48～72h，冷冻干燥即得碱溶性草鱼肝脏蛋白水解物。
水溶性蛋白水解物得率为12.5％，盐溶性蛋白水解物得率为46.3％，醇溶性蛋白水解物为6.4％，碱溶性蛋白水解物为8.2％，以上实验结果表明，连续制备草鱼肝脏蛋白水解物得率较高。
应用实施例1
对实施例1-4所得草鱼肝脏蛋白水解物进行抗氧化测定，具体过程和结果如下。
abts自由基清除率的测定
(1)abts自由基溶液的配制：取0.1gabts和0.029g过硫酸钾溶于100ml磷酸钠缓冲液，混合后于25℃避光反应16h备用，实验时取2ml该反应液，加入18ml磷酸钠缓冲液，配成abts储备液，避光保存当日备用。abts储备液再用磷酸钠缓冲液稀释，于波长734nm处测吸光度在0.85左右，即为abts工作液，当日现配使用。
(2)测定方法：分别取0.1ml样品液，加入3.9mlabts工作液，混合均匀。混合液于室温下静置10min，于波长734nm处测定吸光度a1，以试样溶剂代替样品溶液测定空白吸光度a0，以磷酸钠缓冲液代替abts工作液测得吸光度a2，实验平行做三次，vc作阳性对照。abts自由基清除率计算如式(3)所示：
式中：a1为实验组吸光度；a2为对照组吸光度；a0为空白组吸光度。
抗氧化结果如图1所示。