本发明涉及基因工程
技术领域：
：，尤其涉及一种导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株及其制备方法和应用。
背景技术：
：：许多不饱和脂肪酸因其广泛的生理活性和其在人类健康、营养方面的重要作用越来越受人们关注。微生物油脂的合成过程与动植物几乎相似，最主要的部分就是脂肪酸的合成，主要有两种胞质酶系催化，乙酰coa羧化酶和脂肪酸合酶复合体，以乙酰coa为碳源经过多次碳链延长合成饱和脂肪酸，或再经过去饱和作用合成不饱和脂肪酸。在去饱和过程中主要由各种去饱和酶负责催化，是合成长链不饱和脂肪酸的关键，能在脂肪酸碳链上引入c＝c双键，提高脂肪酸的不饱和度，酵母中广泛存在脂肪酸去饱和酶。而合成不饱和脂肪酸的酶分为两种，甲基定向和羧基定向的脂肪酸去饱和酶。甲基定向的脂肪酸去饱和酶从甲基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为ω-去饱和酶；羧基定向的脂肪酸去饱和酶从羧基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为δ(delta)-去饱和酶，也称为“front-end”去饱和酶。δ9-去饱和酶将第一个碳碳双键引入饱和脂肪酸中，第二个碳碳双键由δ12和δ6-去饱和酶负责引入，δ15去饱和酶则负责引入第三个双键。在细胞合成18c饱和脂肪酸后，硬脂酸经硬脂酰-coa去饱和酶去饱和得到油酸；油酸经δ12-去饱和酶催化生成亚油酸，经δ15-去饱和酶合成α-亚麻酸(ala)；亚油酸经δ6-去饱和酶催化生成γ-亚麻酸gla。其中，δ6-去饱和酶是gla合成途径中的关键酶，第一次克隆出δ6-去饱和酶是1993年从蓝藻中分离克隆得到的，第一次通过生物技术获得gla是在1996年在土豆中表达蓝藻的δ6-去饱和酶基因生产gla。gla在人体中进一步脱氢延长形成花生四烯酸(aa)、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质，对人体有重要生理意义，因而近年人们对δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究热度较高，也取得了较大进展。虽然已经有多篇报道表明，表达外源δ6-脂肪酸脱氢酶在酵母中会使gla含量增加，但是迄今为止，尚未出现利用基因工程构建可以高产γ-亚麻酸(gla)的酵母菌菌株的报道。α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulatinghormone，α-msh)是属于黑皮质家族，是由阿黑皮素原(pomc)派生出来的一种内源性神经肽，由13个氨基酸构成的短肽，在自然界以阳离子的形式存在，是所有黑皮质激素肽的前体蛋白，由脑垂体负责分泌表达。尽管α-msh是由脑垂体产生的，但是在防御细胞、外周组织如皮肤都有它的身影，说明其免疫调节特性。α-msh的生理特性说明了其在机体免疫特别是固有免疫中的重要性以及在抗菌方面也可发挥重要作用。目前对α-msh应用比较广泛的是其抗炎症作用，因其能调节许多炎症因子，说明具有强大的抗炎功能。α-msh对几乎所有类型的炎症都有强大的抑制作用，包括急性炎症、慢性炎症、系统炎症、局部炎症、过敏性炎症以及中枢神经系统的抗炎，作用可通过中枢、外周在多种内分泌、免疫调节系统发挥作用。但由于α-msh本身也存在着缺点，其半衰期较短，在体内半衰期只有20多分钟，所以现行的给药方式是注射，且需不断注射来维持药效，给病人带来不便和痛苦，如果直接口服多肽，体内消化道的酶会将其降解，所以需要开发一种新的口服给药方式来实现这种肽的应用。技术实现要素：针对以上所述现有技术存在的不足，本发明的第一目的是提供一种导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株。本发明的第二目的是提供所述导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株的制备方法。本发明的第三目的是提供所述导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株的应用。为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株，将α-msh多肽导入经δ6-去饱和酶基因重组的粘红酵母gm4-d6d中。将δ6-去饱和酶(d6d)整合到粘红酵母gm4-d6d的基因组中作为表达载体。所述δ6-去饱和酶(d6d)由刺孢小克银汉霉的d6d基因分离与扩增得到。δ6-去饱和酶基因重组的粘红酵母构建方法,其包括的步骤如下：(1)表达载体ppgk1z-rd-me的抽提；(2)连接pgk1基因和d6d基因；(3)pgk1-d6d片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。表达载体ppgk1z-rd-me的抽提的方法的步骤如下：(1)将含有ppgk1z-rd质粒的大肠杆菌dh5α接种到装有5mllb-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；(2)吸取1.5ml过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μlstet缓冲液中，充分混匀；(4)加入4ml新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；(5)将离心管置于沸水浴中45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；(6)挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8ml，5％ctab，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；(7)加入1.2mnacl300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；(8)取1ml70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；(9)沉淀物溶于50mlte缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。连接pgk1基因和d6d基因的引物为：pgk1-bamhiprimer1：5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)pgk1-xhoiprimer2：5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtagatgtcgcctattatt-3′(xhoi)d6d-xhoiprimer1：5′-tctgctttcttcgctccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)d6d-xhoiprimer2：5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)粘红酵母与d6d基因片段的摩尔比要控制在1:3-10。一种导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株的制备方法，包括的步骤如下：(1)制备工程菌株gm4-d6d菌株感受态细胞。(2)将10μg修饰了的fitc-αmsh溶解后与感受态细胞混合后共100μl，加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；(3)电击化；(4)电击结束后，立即向转化杯中加入900μl预冷的1m山梨醇溶液，用枪轻微吸打混匀，然后将其转至灭过菌的离心管中，30℃静置lh，离心后加入1ml新鲜的ypd培养基重悬菌体，30℃，200rpm摇1小时；(5)最后得到的菌株分别命名为gm4-d6d-fαmsh；所述电击化步骤如下：(1)将80μl己制备好的感受态细胞与20μl(约10μg)已线性化好的待转化质粒dna混合,加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；(2)将装有混合液的电转化杯冰浴5min；(3)调整好电转仪的参数:电压1.5kv，电容25uf，电阻200ω，电击持续时间约为5ms左右；(4)电击结束后，立即向转化杯中加入1ml预冷的1m山梨醇溶液,用枪轻微吸打混匀,然后将其转至灭过菌的离心管中,30℃静置lh，然后加入1ml新鲜的ypd培养基，30℃，200rpm摇1小时；(5)室温下3000rpm，离心4min，用200μlddh2o重悬菌体；(6)将消液涂布于ypd平板(含50μlzeocin)，置于30℃培养箱中培养2-3d,直到长出单菌落为止。所述导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株用于治疗肠道炎性疾病药品和功能性食品制备中的应用，可以做成生物胶囊。特别是用于治疗结肠炎药品中的应用，可以是水剂或者粉剂。所述导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株还可以用于与msh作用相关的食品或药品制备中的应用。本发明具有如下有益效果：成功构建了外源基因d6d表达载体ppgk1z-rd-d6d，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株pcr鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了d6d的稳定、长久表达；实时荧光定量pcr表明d6d的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的gla较野生菌株提高了3.3倍多；gm4-d6d-αmsh组的小鼠的血清和肝脏中亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸的相对含量较normal组的显著增加，其中血液中gm4-d6d-αmsh组的gla含量较normal组提高了约7.26倍，花生四烯酸提高了约1.55倍；肝脏中gm4-d6d-αmsh组的gla含量较normal组提高了约4.33倍，花生四烯酸提高了约1.28倍；因为本身gm4-d6d-αmsh菌株可产生较多的γ-亚麻酸，所以小鼠口服会使血清中的gla的含量增多，同时与对照组相比，gm4-d6d-αmsh组中花生四烯酸增多可能是因为部分γ-亚麻酸向花生四烯酸转化。附图说明图1是粘红酵母整合表达载体ppgk1z-rd-d6d的构建的技术路线图；图2是菌落形态图观察照片；图3是pgk1(a)和d6d(b)基因的pcr扩增条带图；图4是粘红酵母转化菌株gm4-d6d的插入片段d6d的pcr检测图(其中1、2、3道为重组菌株，4、5、6道为空载体菌株)；图5是重组质粒ppgk1z-rd-d6d双酶切鉴定图(以ppgk1z-rd做对照，其中1道为ppgk1z-rd-d6d，2道为ppgk1z-rd)；图6是粘红酵母d6d基因表达水平图；图7是共聚焦显微镜图片分析fitc标记的多肽进入胞内后的位置油滴用尼罗红染色图，其中(a)红色荧光通道，(b)绿色荧光通道，(c)a和b两张图的叠加图；图8是电转化进入胞内的多肽的浓度图；图9是血清中α-msh的浓度如；图10是α-msh的组织分布图；图11是为结肠黏液中α-msh的浓度曲线图；图12是结肠组织中mpo的活性；图13是结肠组织中细胞因子表达图；图14是结肠组织病理切片图(100x)。具体实施例为了更好地阐述本
发明内容，下面用若干较佳的具体实施例进行说明。但这些具体实施例只是为了说明本发明的内容，而不是对本
发明内容进行限制。2.1实验材料与仪器说明2.1.1菌种粘红酵母(rhodotorulaglutinis)gm4为经筛选并保存(cctccm2012203)；酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)2.1445购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmmcc)；刺孢小克银汉霉(cunninghamellaechinulata)mian6；大肠杆菌(escherichiacoli)dh5α。2.1.2质粒表达载体ppicz-rd，构建并保存。2.1.3培养基及主要试剂(1)ypd培养基(1l)、ypd-zeocin培养基(1l)，luria-bertani(lb)培养基(1l)，lb-ampicillin培养基(g/l)，低盐lb-zeocin培养基，potatodextroseagar(pda)培养基(g/l)；(2)stet缓冲液,te缓冲液,10％sds；(3)质粒提取液；(4)10xdnabuffer链接缓冲液；(5)tricinesds-page电泳试剂；负极正极缓冲液(10x)，凝胶缓冲液(3x)，固定液，染色液，脱色液，样品缓冲液，ab-3储存液(49.5％t，3％c)，ab-6储存液(49.5％t，3％c)，16％分离胶，10％夹层胶，4％浓缩胶。以上溶液均按已知的现有固定方法配置。2.2.1目的基因的分离与扩增2.2.1.1酿酒酵母pgk1基因的分离与扩增1、分离：酿酒酵母接种于50ml/250mlypd液体培养基中，30℃，180rpm培养至od660＝3时离心(12000r/min，5min，4℃)，弃上清，收集菌体。无菌水冲洗菌体两次后离心，后用冷无菌水重悬菌体，菌悬液转至含液氮和1g矾土的研钵中研磨破碎菌体细胞，然后转至5mldna提取缓冲液中(50mmtris,10mmmgcl2,50mmnacl，1％(wt/vol)sds，ph7.4)的离心管中。经过反复的苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀步骤，酿酒酵母dna被分离出来。2、pcr扩增：根据pgk1基因序列，设计引物：正向引物5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)反向引物5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtag-3′(xhoi)pcr反应按takarapcr反应试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司)pcr反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环，取5μlpcr扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。2.2.1.2刺孢小克银汉霉d6d基因的分离与扩增1、分离：刺孢小克银汉霉总rna的提取操作流程参考wan和zhang等人的方法，用oligotexmrnaminikit(qiagen)从总rna中提取mrna。2、pcr扩增：根据已公布的刺孢小克银汉霉d6d基因序列(genbankaccessionnumber：dq177498)，设计d6d引物。正向引物5′-ccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)反向引物5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)3、反转录(rt)反应：(1)反转录按takara反转录试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司)；(2)37℃反应1小时；(3)75℃孵育15分钟终止反应，保存于-20℃或直接用于下游实验。4、pcr反应：pcr反应按takarapcr反应试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司)pcr反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环，取5μlpcr扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。2.2.1.3凝胶电泳与pcr产物回收1、凝胶电泳：按照凝胶电泳常规操作步骤进行操作。2、pcr产物回收：使用紫外光显影出目的dna条带，用切片刀切割相应的琼脂带，置入离心管中；具体的操作为：加入bindingbufferii(7～4μl/1mg琼脂凝胶)，于60℃水浴摇匀，直至完全溶解；将溶解的琼脂凝胶放进uniq-10柱子中5min,用收集管收集滤液，8000rpm常温离心15min；弃去收集的废液，取下uniq-10柱，入600μlwashsolution，8000rpm离心2min；重复弃去收集的废液，取下uniq-10柱，入600μlwashsolution，8000rpm离心2min；取出uniq-10柱放于新的离心管中，在柱子膜中央加入40μlelutionbuffer，50℃中放置5min；室温下12000rpm离心1min，液体即为回收dna，-20℃冻存备用。2.2.2表达外源d6d整合载体ppgk1z-rd-d6d的构建2.2.2.1整合载体ppgk1z-rd-d6d的构建路线图利用同源重组原理设计d6d基因整合表达载体，构建技术路线见图1：2.2.2.2表达载体ppgk1z-rd-me的抽提ppgk1z-rd质粒为本实验室构建并保存的，按照常规质粒提取步骤抽提。2.2.2.3重叠pcr连接pgk1和d6d用于pgk1和d6d的overlappcr引物如下：pgk1-bamhiprimer1：5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)pgk1-xhoiprimer2：5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtagatgtcgcctattatt-3′(xhoi)d6d-xhoiprimer1：5′-tctgctttcttcgctccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)d6d-xhoiprimer2：5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)5个循环后回收pgk1和d6d片段，以回收的pgk1和d6d片段为共同模板，pgk1-bamhiprimer1和d6d-xhoiprimer2为上、下游引物进行overlappcr，得到pgk1-d6d片段。erlappcr反应按takarapcr反应试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司).pcr反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环。2.2.2.4pgk1-d6d片段与载体的双酶切反应、连接1、将overlappcr产物与ppgk1z-rd分别进行ncoi和bamhi双酶切质粒ppgk1z-rdncoi/bamhi双酶切反应体系：质粒ppgk1z-rd-me：15μl，ncoi内切酶：2μl，bamhi内切酶：2μl，10×buffer：5μl，1％bsa：5μl，ddh2o：26μl。片段pgk1-d6dncoi/bamhi双酶切反应体系：片段pgk1-d6d：10μl，ncoi内切酶：2μl，bamhi内切酶：2μl，10×buffer：5μl，1％bsa：5μl，ddh2o：26μl。酶切反应在37℃水浴反应3小时。2、连接反应酶切反应后,构建重组质粒ppgk1z-rd-d6d。连接反应反应体系如下:片段pgk1-d6d酶切纯化产物：6μl，载体ppgk1z-rd酶切纯化产物：2μl，10×t4dnaligasebuffer：1μl，t4dna连接酶：1μl。16℃水浴过夜反应,载体与外源dna片段的摩尔比要控制在1:3-10。2.2.3重组质粒ppgk1z-rd-d6d电转化粘红酵母感受态细胞2.2.3.1粘红酵母感受态的制备挑取酵母单菌落接种在5mlypd液体培养基，于30℃，250rpm振荡培养过夜；以1％接种量转接至100mlypd液体培养基，于30℃，250rpm振荡培养至细胞od600≈1.4；菌液于4℃，3000g离心5min沉淀细胞，弃上清，用100ml无菌水重悬；重复一次；4℃，3000g离心2min沉淀细胞，弃上清，用20ml冰预冷的1m山梨醇重悬细胞；4℃，3000g离心2min沉淀细胞，弃上清，用200μl1m山梨醇重悬细胞，用于转化。2.2.3.2质粒线性化将约10μg重组质粒ppgk1z/rd/d6d用saci进行单酶切。酶切体系如下所示:saci：1μl，10×buffer：5μl，质粒ppgk1z-rd-d6d：10μl，ddh2o：7μl。2.2.3.3电转化将线性化好的重组质粒电转化至粘红酵母gm4，电转化步骤按照常规电转化方法操作。2.2.3.4重组粘红酵母的pcr检测(1)挑取ypd抗性平板上长势较好的单菌落转接到ypd液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养至od600大于2；(2)取1ml菌液12000rpm离心2min，弃上清，加入100μlte缓冲液重悬菌体，水浴煮沸5-10min，立即置于-20℃冰箱冻存15min，室温下静置使菌悬液溶解，12000rpm离心5min，取上清液5μl为模板进行pcr检测。pcr反应按takarapcr反应试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司)pcr反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃0.5min，72℃1.5min，72℃5min，30个循环。2.2.3.5质粒的酶切验证经菌液pcr初步验证后，提取正确阳性克隆中的质粒，用ncoi和bamhii分别对重组质粒进行双酶切鉴定，反应温度为37℃。酶切反应体系如下：质粒：2μl，10×buffer：4μl，ncoi：1μl，bamhii：1μl，ddh2o：41μl。2.2.3.6转化子稳定性检测将粘红酵母转化子接种于40mlypd液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养24h-36h。取1ml菌液用无菌水分别稀释到10-2,10-3,10-4，各取200μl不同稀释度的稀释液分别涂布于普通ypd平板和ypd-zeocin抗性平板，计算菌落数，分别记为总菌数和带有整合质粒的菌落数。以1％接种量转接至ypd液体培养基，30℃，250rpm振荡培养，以24h为10世代，共培养50个世代。每隔10世代进行一次平板计数。计算质粒稳定性：稳定性(％)＝带有整合质粒的菌落数÷总菌数×100％。2.2.4转化子d6d表达水平测定实时荧光定量pcr检测d6d在转化菌株中的表达水平。野生菌株gm4和转化菌株gm4-d6d分别在ypd培养基中发酵24h、48h、72h后收集，提取野生菌株和转化菌株的总rna，方法参照前面2.2.1.3；经反转录得到cdna，方法参照2.2.1.3。将合成后的cdna稀释30倍,按照荧光定量试剂盒sybrprimescripttmrt-pcrkit指导进行。d6d的实时荧光定量pcr引物为：f:5′-atgtcagggcaaactcgag-3′；r:5′-atcatctaaaacatcttttgagag-3′荧光定量pcr按照biort实时荧光rt-pcr试剂盒方法检验(购自杭州博日科技有限公司)pcr扩增条件为：95℃3s，95℃5s，60℃31s，40个循环。同时对real-timepcr产物进行sybr熔解曲线分析，每个试样平行做4次反应，重复试验2次，并参考pfaffl(2001)的方法进行数据分析。2.2.5转化菌株gm4-d6d的脂肪酸组成分析1、菌株gm4-d6d总脂肪酸的提取收集稳定期的gm4-d6d菌株，离心后用蒸馏水清洗两遍，5000g于4℃离心5min收集菌体后烘干至恒重，研磨成粉末，用滤纸包好菌粉再次烘干至恒重；将滤纸包裹的菌粉放于抽提筒中，注入无水乙醚浸没样品，在70度左右的恒温水浴中回流抽提8h左右，除去溶剂后的油脂待用；加入1ml2％(wt/vol)硫酸-甲醇，60℃酯化2h；冷却后加入1ml己烷，涡旋10min；取上步乙烷800μl加入到玻璃瓶中进行gc分析。2、gc分析用bruker450-gc仪器配氢火焰离子化(fid)检测器和毛细管色谱柱hp-innowax(30m×0.25mm)。按照gc常规操作对不同脂肪酸进行定性定量分析。结果证明2.3.1粘红酵母的菌落形态粘红酵母gm4在孟加拉平板上生长3天后，形态如图2。菌落平均直径3～5mm，颜色为红色或橘红色，光泽，表面光滑且边缘整齐，呈圆形凸起。2.3.1pcr扩增检测目的片段设计特定引物对摸底基因pgk1和d6d进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，图3中(a)显示在800bp左右扩增出目的条带，图3中(b)显示在13000bp左右扩增出目的条带。将重组质粒经过电转化法导入粘红酵母感受态细胞，对粘红酵母的细胞裂解液进行pcr检测，以目的基因d6d的特异性引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，图5显示1、2、3通道(重组菌株)在13000bp左右扩增出目的条带，阴性对照(空载体菌株，即野生粘红酵母菌株gm4，没有重组质粒转化)则无条带。说明重组质粒pgk1z-rd-d6d成功转入粘红酵母并插入到粘红酵母基因组中。重组菌gm4-d6d经过培养后，提取质粒，经过ecori和hindiii双酶切后电泳成像，结果如图4，可看到在2100bp和3100bp左右有条带(通道1)，酶切后的片段大小与所插入的目的基因片段大小相符，说明重组质粒上的目的基因片段的插入方向正确。2.3.2重组质粒稳定性检测为了检测重组质粒ppgk1z-rd-d6d的遗传稳定性，我们对转化菌株在非选择压力下摇瓶培养60世代，沾取菌液于zeocine抗性平板上涂布、培养，计算菌落数。结果如表2-1所示，显示转化的粘红酵母菌株在连续培养60世代后，稳定性仍然可以达到99.31％，表明在非选择压力下，粘红酵母中的质粒具有良好的遗传稳定性。表2-1重组质粒的稳定性检测2.3.3转化粘红酵母菌株d6d的表达分析实时荧光定量pcr分析d6d基因转录水平的结果见图6，转化菌株的d6d表达水平为野生菌株的2倍左右，野生菌株d6d转录水平在培养72小时后降到较低水平，而转化菌株在其生长和γ-亚麻酸表达阶段，其d6d的转录水平一直都高于野生菌株。d6d的高转录水平可以可以为γ-亚麻酸的和合成提供所需的足够的酶，从而使γ-亚麻酸的合成量维持在较高的水平。2.3.4γ-亚麻酸的积累研究为了过表达d6d基因的粘红酵母转化菌株是否会产生较高水平的gla，实验过程中对其脂肪酸成分进行了测定及分析，发现转化菌株的gla含量显著增高，由原来的3.12％提高到10.36％，同时gla合成的底物亚油酸的含量明显降低，由此可以看出，与野生菌株相比，转化菌株可以积累更多的gla。表2-2转化菌株和野生菌株的脂肪酸组成本发明中，δ6-脂肪酸去饱和酶是合成长链多不饱和脂肪酸的限速酶，分别在n-3途径中催化ala脱氢生成sda和n-6途径中的油酸(la)脱氢生成gla。在γ-亚麻酸的生物合成过程中，△6-脂肪酸去饱和酶将la的第六位碳原子脱氢转化成gla。经过研究者们不断努力，已经有不少gla代谢关键酶的编码基因被克隆并且实现功能验证，有的基因还被利用到脂肪酸代谢途径修饰中，并取得理想效果。如laoteng等成功分离mucorrouxii中的δ6-脂肪酸去饱和酶，发现其于植物的δ6-脂肪酸去饱和酶有高度的相似性，并使其在酿酒酵母中成功得以表达；helu等人发现在豆豉的发酵过程中会有大量的gla产生，因此分离出高产gla的根霉菌，并从中克隆得到δ6-脱饱和酶基因，将其表达于酿酒酵母中可导致gla的积累；王萍等人将刺孢小克银汉霉菌中的δ6-脂肪酸去饱和酶表达于橘林油脂酵母中，使其gla的含量占总脂肪酸的1.2％。而本实验中，经过脂肪酸分析，发现转化菌株中的la明显低于野生菌株，这也可以从侧面反应出la经d6d催化进一步合成了gla，从而使转化菌株中la的含量降低，gla的含量增多。粘红酵母是一株高产油脂的稳定菌株，常备用来生产微生物油脂和不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等。本实验室前期筛选到一株产脂能力较强的粘红酵母，其脂含量可以高达22.54％。在本实验中，我们利用了本实验室前期的粘红酵母表达质粒构建工作，成功构建整合表达载体ppgk1z-rd-d6d，该载体上含有粘红酵母的两个rdna片段以及酿酒酵母的强启动子pgk1，以rdna为整合位点实现目的基因的稳定高拷贝表达，从而将外源刺孢小克银汉霉菌的d6d基因整合到粘红酵母的染色体上，使其能够稳定、高效表达，结果显示传代60代后，质粒仍能稳定存在于转化株内，并且粘红酵母转化菌株的d6d表达水平明显高于野生菌株，其gla的产量也明显提高。总的来说，本发明成功构建了外源基因d6d表达载体ppgk1z-rd-d6d，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株pcr鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了d6d的稳定、长久表达；实时荧光定量pcr表明d6d的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的gla较野生菌株提高了3.3倍多。引入外源多肽的粘红酵母工程菌及外源多肽在胞内的定位制备材料3.1.1试验菌株粘红酵母重组菌株gm4-d6d3.1.2培养基同2.1.23.1.3主要试剂0.5mg/ml的尼罗红染色剂；fitc和plam修饰的α-msh和h22lp引入外源多肽的方法3.2.1电穿孔方法介导外源多肽进入gm4-d6d胞内1、制备工程菌株gm4-d6d菌株感受态细胞，方法同2.2.3.1。2、将10μg修饰了的fitc-αmsh和fitc-h22lp溶解后与感受态细胞混合后共100μl，加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；3、电击过程按常规操作；4、最后得到的菌株分别命名为gm4-d6d-fαmsh和gm4-d6d-fh22lp；5、将α-msh通过电穿孔转入gm4-d6d胞内，得到菌株gm4-d6d-αmsh。3.2.2激光共聚焦检测多肽在胞内的位置分别取0.1mlgm4-d6d-fαmsh和gm4-d6d-fh22lp菌液在1.5mlep管中，3000rpm离心5min，用0.1ml蒸馏水重悬，加入几滴尼罗红染料，避光保存2-3min，然后通过共聚焦显微镜(tcssp2)观察。观察绿色荧光用488nm的激光源，观察红色荧光用514纳米的激光源。3.2.3荧光分光光度计定量分析(1)配制fitc-αmsh和fitc-h22lp的浓度梯度标准液；并取1ml标准液到1毫升比色皿，待测定荧光强度fs；移取1毫升gm4-d6d-fαmsh和gm4-d6d-fh22lp菌液到1毫升比色皿，待测荧光强度fx；配制空白溶液于1毫升比色皿，待测荧光强度f0；(2)做(fs-f0)与待测样品标准品浓度c之间的标准曲线；根据(fx-f0)从标准曲线上求得样品的含量。(3)数据分析数据分析使用graphpadprism5.0，统计数据用mean±sd表示，组间的差异性分析采用单因素方差(one-wayanova)。3.3实验结果3.3.1共聚焦显微镜(clsm)的方法验证多肽进入胞内的位置为了检测多肽是否进入胞内以及他们在胞内的位置，用疏水性荧光物质尼罗红染料染色脂滴如图7所示，分别使用红色和绿色荧光通道则分别可以看到尼罗红染色的脂滴和显绿色的多肽fitc-fαmsh和fitc-fh22lp，而把两张图叠加，发现红色和绿色的荧光点完全重合(绿色荧光点要比红色的荧光点要小些)，叠加后呈黄色，表明两种物质存在于同一个纳米粒子内。这可说明两种多肽均引入到胞内，并且因为自身的亲脂作用进入到脂滴里。3.3.2荧光分光光度法测定胞内多肽fitc-αmsh和fitc-h22lp的含量电转化后，我们离心出去溶液中的多肽，收集菌液，运用荧光分光光度法测定胞内多肽fitc-αmsh和fitc-h22lp的含量，从图8可以看出，两种多肽的浓度差别不大，均为3mg/ml左右，而最初电转化时多肽的浓度为10mg/ml，说明电转化后胞内多肽的浓度可到达最初浓度的1/3，而且两种多肽在胞内的浓度没有显著性差异。我们将外源多肽通过电穿孔的方法使其进入粘红酵母gm4-d6d胞内，得到菌株gm4-d6d-fαmsh和gm4-d6d-fh22lp，因为我们使多肽具有脂溶性，所以从激光共聚焦的图中可以看出他们进入到粘红酵母的油滴中，同时通过荧光分光光度法测定胞内多肽fitc-αmsh和fitc-h22lp的含量，发现通过电穿孔的方法可以将越1/3的外源多肽转移到粘红酵母胞内，而mark等人利用电穿孔的方法将牛血清白蛋白转进红细胞中的最大量为1/4；并且两种多肽通过电穿孔进入到胞内后的含量差别不大，均为3μg/ml，说明此方法也适用于多肽转化进入粘红酵母胞内。曾经有文章报道口服活酵母做为疫苗的载体，用将酵母制作成微囊做为天然脂质体包裹药物，或者口服灭活的酵母传递多不饱和脂肪酸，在这里酵母充当的是天然生物胶囊的角色，可以通过口服整个酵母来实现药物的运输以及不饱和脂肪酸等。总的来说，本发明通过电穿孔的方法使fitc-αmsh和fitc-h22lp进入到粘红酵母gn4-d6d胞内；激光共聚焦实验证明两种多肽进入到油滴内；荧光分光光度法测定胞内多肽fitc-αmsh和fitc-h22lp的含量，发现两种肽的含量没有显著性差异，并且为初始量的1/3。健康小鼠体内研究4.1实验材料与仪器4.1.1实验菌株菌株gm4-d6d-αmsh和gm4-d6d4.1.4实验小鼠15只spf级balb/c小鼠，购买于中山大学实验动物中心。4.2实验方法4.2.1gm4-d6d-αmsh的小鼠体内研究4.2.1.1α-msh在血清中的浓度1、小鼠分组(1)gm4-d6d-αmsh组，6只；(2)gm4-d6d组，6只做为对照；2、小鼠眼球取血饲喂后的第1,3,5,7天，眼球后静脉丛取血法取血(一次采血0.2ml)。3、测血清中α-msh浓度2500rpm离心15min，取适当浓度为300pg/ml的标准品稀释为一系列浓度梯度的稀释液；用elisa试剂盒测血清中α-msh浓度,操作方法遵循elisa试剂盒说明。4.2.1.2α-msh组织分布上述小鼠经过7天的给药以及取血后，在第七天将小鼠颈椎脱臼处死，分别取肝、脾、肺、肾，清除其上面的连带脂肪组织和结缔组织，生理盐水冲洗干净，用滤纸将组织吸干；剪取适量组织，精确称重后加入1ml生理盐水制成匀浆；制成匀浆的样品在200rpm，25℃下震荡20min，然后在25000rpm下离心15min；将上清过0.22μm微孔滤膜，去除杂志后用elisa试剂盒测α-msh浓度，方法同上。4.2.2血清及肝脏脂肪酸组分测定4.2.2.1小鼠分组gm4-d6d-αmsh组，取6只正常小鼠，每天除饲喂正常的饲料，还饲喂gm4-d6d-αmsh菌株，每只每天饲喂量为1×1010cfu；normal组，取6只正常小鼠，每天只饲喂正常的饲料和同等体积的生理盐水，做为对照。4.2.2.1血清中脂肪酸测定在饲喂7天，小鼠通过眼球取血，离心后将血清样品甲脂化，处理后取上清进行gc-ms分析，方法同2.2.5。4.2.2.2肝脏中脂肪酸测定同样在第七天颈椎脱臼处死小鼠，取80mg肝脏，加入氯仿:甲醇＝2:1的萃取溶剂，匀浆后移入离心管中，25000rpm离心15min，沉淀重复一次萃取过程，合并两次离心上清。加入0.2倍体积的1.45mm的nacl溶液，取下层氮气吹干，甲酯化处理同血清样品。4.2.3数据处理数据处理及作图使用graphpadprism5.0，统计数据用平均数±标准差表示，组间的对比采用单因素方差分析(one-wayanova)，两组之间的数据分析采用student’stest，p<0.05认为是组间存在显著差异。4.3实验结果4.3.1α-msh在血清以及组织中的检测为了检测gm4-d6d-αmsh运载α-msh的效果，我们使小鼠服用gm4-d6d-αmsh后，在第1、3、5、7天通过眼球取血，用elisa试剂盒检测血清中α-msh的浓度，服用gm4-d6d的小鼠作对照。如图所示，在gm4-d6d-αmsh组，α-msh在血清中的含量随着服用天数的增加而增加，在1至5天，α-msh的含量几乎呈直线增加，在5天后，几乎不增加并且趋向于平稳，而在gm4-d6d组，α-msh的含量在一定浓度一直保持平衡状态，且gm4-d6d-αmsh组α-msh在血清中的含量显著高于gm4-d6d组(p<0.05)。由小鼠组织分布图(图10)可见，gm4-d6d-αmsh运载α-msh使其在肝、肺、脾、肾中的分布显著增加，尤其在肝的分布浓度由5.35pg/g提高至17.36pg/g，提高了3.24倍，而几乎不进入心肌组织。这可能是与脂质主要在肝脏代谢的原因，我们猜测α-msh很可能是随着脂质形成乳糜微粒而被携带，并一起进入淋巴系统，最后进入血液，运送到身体各个组织，尤其是脂质代谢的主要器官肝脏。4.3.2脂肪酸成分分析从表4-1中的数据可以看出，gm4-d6d-αmsh组的小鼠的血清和肝脏中亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸的相对含量较normal组的显著增加，其中血液中gm4-d6d-αmsh组的gla含量较normal组提高了约7.26倍，花生四烯酸提高了约1.55倍；肝脏中gm4-d6d-αmsh组的gla含量较normal组提高了约4.33倍，花生四烯酸提高了约1.28倍。因为本身gm4-d6d-αmsh菌株可产生较多的γ-亚麻酸，所以小鼠口服会使血清中的gla的含量增多，同时与对照组相比，gm4-d6d-αmsh组中花生四烯酸增多可能是因为部分γ-亚麻酸向花生四烯酸转化。表4-1血清脂肪酸成分分析表(％)表4-2肝脏脂肪酸成分分析表(％)抗炎活性评价实验证明5.1实验材料5.1.1培养基及试剂配制(1)lps(脂多糖)溶液，rmpi-1640培养液；(2)蛋白酶抑制剂，电转缓冲液，裂解液，转膜液，甘氨酸电泳缓冲液，pbst；以上试剂，按常规方法配制。5.2实验方法5.2.1pbmc(外周血单个核细胞)的分离抽取健康志愿者的血液36ml至离心管中，加入4mlacd抗凝剂；贴着管壁缓慢加入72ml淋巴细胞分离液，于25℃下2000rpm离心15min；用注射器吸取第二层的白色的单个核细胞；将吸取的单个核细胞置于新的试管中，测量体积，加入等量的淋巴细胞分离液，在25℃下1500rpm离心10min，收集单个核细胞，重复操作5次；将收集到的单个核细胞用含10％胎牛血清的rmpi-1640培养液重悬，取少量用台盼蓝染液染色，于显微镜下观察细胞(死亡细胞为兰色，活细胞无色)；计算细胞活力(细胞活力＝活细胞数/细胞总数x100％)；将细胞密度调节为1x106/ml，恒温培养箱培养，备用。3.2.2重组菌细胞培养上清液处理lps刺激的pbmc(a)取dmem缓冲培养基培养10h的菌体培养液，常温下3000rpm离心10min，弃去菌体，收集上清液，部分用3μg/ml弗林蛋白酶酶切后，用0.22μm滤膜过滤除菌，收集滤液；(b)用α-mshelisa试剂盒检测重组菌培养上清液中的α-msh浓度，将α-msh浓度用dmem缓冲培养基调整至80pg/ml，其它非重组菌的上清液也稀释相同的倍数；(c)将pbmc细胞按每孔1ml接种于细胞培养板，实验之前除去培养基，开始后加入上述用浓缩一倍的rmpi-1640培养液稀释一倍后的双歧菌培养上清液。实验分为六祖，每组设5个复孔。正常组(n组)，该组在实验中仅更换用pbs溶液稀释浓缩一倍rmpi-1640培养液；lps组，更换用pbs溶液稀释浓缩一倍rmpi-1640培养液后1h，用终浓度为5μg/ml的lps刺激8小时；pdg7组(空载体组)，弃去培养基后，加入用浓缩一倍的rmpi-1640培养液稀释一倍后的空载体双歧菌培养上清液孵育1h，之后用终浓度为5μg/ml的lps刺激8小时；pdg7+furin组，与pdg7组处理相同，只是双歧菌培养上清液经过弗林蛋白酶酶解；pbdmsh组，与pdg7组处理不同的是，用的是分泌α-msh的导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株；pbdmsh+furin组，用经过弗林蛋白酶酶解的导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株培养上清液孵育1h，之后用终浓度为5μg/ml的lps刺激8小时；α-msh组为合成的α-msh作为对照。5.2.3westernblot检测nf-κb蛋白表达a.总蛋白提取收集处理后的细胞，移至离心管中，4000rpm于4℃下离心8min，除去上清液，加入用冰预冷的pbs液洗涤3次，4000rpm于4℃下再次离心8min，除去上清液，即刻置于冰上冷冻；加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液，使劲吹打，冰上放置0.5h后12000rpm于4℃下离心10min，将上清液转移至另一个干净的离心管中，使用bca法测量蛋白含量，备用或-80℃保存；样品总蛋白含量为100～150μg左右，取蛋白上样缓冲液和和上清液，按1/3比例混匀，沸水水浴15min使蛋白变性，于冰上静置10min，冷却后电泳。b.电泳电泳胶按常规方法配制。开始电泳时，电压维持在100v，等溴酚蓝跑到分离胶时(大约需要2h)，将电压提高至150v，当电泳至溴酚蓝到达分离胶顶部时，停止电泳，准备转膜。c.转膜按常规操作方法进行转膜。d.免疫检测将膜用pbst清洗3次，每次10min，置于含有封闭液中，室温下脱色摇床上振动封闭1h；一抗稀释1000倍，4℃下脱色摇床上孵育一夜，清洗；二抗稀释1000倍，常温下脱色摇床上孵育1.5h；将膜浸泡于洗脱液中，55℃烤箱孵育30min，用pbst清洗3次，每次10min；在成像系统中成像，用imagej分析灰度。3.2.4检测培养上清液tnf-α分泌收集lps刺激后的培养上清液，3000rpm离心15min，收集上清，用人双抗体夹心tnf-αelisa试剂盒检测上清液中tnf-α的浓度，其步骤按照tnf-αelisa试剂盒操作。5.2.5数据处理数据处理及作图使用软件graphpadprism5.0，统计数据用平均数±标准差表示，组间的对比使用单因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05认为是组间存在显著差异。5.3实验结果5.3.1分离后pbmc的活力具有活性的pbmc，因其细胞膜完好，台盼蓝不能进入细胞，显无色；死亡的pbmc，，台盼蓝能进入细胞内，显兰色；观察200个细胞，无色的细胞有192个，细胞活力96％，可用于后续的α-msh抗炎活性检测。5.3.2pbmc中nf-κbp65蛋白表达以β-actin作为参照，用imagej分析nf-κbp65的表达，结果表明：dss诱导后nf-κbp65的表达大大升高(与正常组相比p＜0.01)；使用导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株培养上清处理后，nf-κbp65的表达有效下降(pdg7组、pdg7+furin组与lps组相比p＜0.05)，转化空载体的培养上清液在弗林蛋白酶酶解前后对tnf-α释放无影响(pdg组与pdg7+furin组对比，p＞0.05)而使用分泌α-msh前体蛋白的细菌培养上清液处理后，这种作用抑制nf-κbp65表达的作用更加显著(pbdmsh组，pbdmsh+furin组与lps组、pdg7组相比，p＜0.01)，如见表3-1所示。表3-1nf-κbp65表达相对灰度值table3-1relativegrayvalueofnf-κbp65expression注：ap＜0.01与n组对比,bp＜0.05与lps组对比，cp＜0.01与lps组、pdg7组比较，n＝5。5.3.3重组菌培养上清抑制lps刺激pbmc的tnf-α释放pbmc加入lps刺激8h后，上清液中的tnf-α浓度大量升高(与正常组相比p<0.01)；转化空载体的培养上清液在弗林蛋白酶酶解前后对tnf-α释放无影响(pdg组与pdg7+furin组比较，p＞0.05)；转化空载体的双歧菌的上清液能显著抑制lps刺激的tnf-α的产生，即pdg7组、pdg7+furin组与lps组相比p<0.05；分泌α-msh前体蛋白的细菌上清液与转化空载体组、lps组相比pbdmsh组与lps组、pdg7组比较)，能显著抑制tnf-α的分泌(p<0.05)；但重组菌上清液经过弗林蛋白酶酶解后，其抑制tnf-α表达的活性大大提高(pbdmsh+furin组与lps组、pdg7组，p<0.01)，说明酶解后得到完整的α-msh并且该α-msh发挥了它的抗炎活性。导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株对实验性结肠炎的作用实验6.1材料6.1.1主要试剂：3.5％dss溶液6.1.3实验小鼠46只spf级balb/c小鼠购买于中山大学实验动物中心，合格证书号码为：scxk粤2011--00296.2方法6.2.1动物模型的构建取40只小鼠，给予3.5％dss溶液作为自由饮用水，连续喂养7天，观察小鼠的粪便，腹泻状况，检测小鼠血清中tnf-α含量，确定造模，对于造模不成功的小鼠舍弃不用。6.2.2分组处理n组(正常组)，6只未建模的小鼠；dss组，8只建模的小鼠；pdg7组(空载体组)，取8只建模的小鼠，每天除饲喂正常的饲料，还饲喂转化空载体的导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株，每只每天饲喂量为1×1010cfu；pbdmsh组，取8只建模的小鼠，每天除饲喂正常的饲料，还饲喂分泌α-msh的重组导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株bl-pbdmsh，每只每天饲喂量为1×1010cfu。在饲喂导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株七天后，安乐死小鼠，切取结肠后端组织，用于检测组织中的mpo、tnf-α、il-1β、il-6、il-10以及病理切片观察；对结肠膜粘液中的α-msh检测，则是在饲喂双歧菌后第1，3，5，7天检测。6.2.3结肠粘液α-msh检测在饲喂双歧菌后第1，3，5，7天，收集结肠粘液，3000rpm常温下离心20min，除去沉淀，上清液中的α-msh用人α-mshelisa试剂盒检测，具体方法见2.2.5。6.2.4mpo检测mpo的检测使用fabia[57]法，根据试剂盒操作4.2.5细胞因子tnf-α、il-1β、il-6和il-10的测定称取结肠组织0.1g，加入pbs缓冲液到0.5ml，充分匀浆，4℃下5000rpm离心20min，弃去沉淀，收集上清液备用。a.tnf-α检测采用方程公司的试剂盒，操作步骤按照试剂盒说明b.il-1β、il-6和il-10的测定采用博凌科为公司的试剂盒，步骤按照试剂盒说明4.2.6组织病理切片观察取结肠组织，用生理盐水清洗3次，切去不整齐部分，洗净的组织置于于含10％甲醛的溶液中浸泡5h；脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色、封存后显微镜下观察并拍照。6.2.7数据处理数据处理及作图使用软件graphpadprism5.0，统计数据用平均数±标准差表示，组间的对比采用单因素方差分析(one-wayanova)，两组之间的数据分析采用student'sttest，p<0.05认为是组间存在显著差异。6.3结果6.3.1模型构建小鼠饮用含有3.5％dss的水溶液七天后，出现了拉稀症状，粪便稀糊状，粪便中伴随血迹，血清中的tnf-α由9.20±0.41pg/ml上升至19.22±1.07pg/ml(p<0.05)，说明造模成功。6.3.2α-msh检测结肠炎小鼠服用双歧菌后，在服用后的第1，3，5，7天，检测结肠粘液α-msh浓度。在pbdmsh组，我们可以看到，随着服用的天数，α-msh的量持续增长：在1-5天，α-msh迅速增加，在5-7天，α-msh增加的量相对少，趋于一个平稳的状态，其原因可能是在后几天，结肠内的导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株到达顶峰不再增加；表达量与pdg7(空载体组)组相比，p<0.001。而在pdg7组，表达量在检测度之内，一直保持平衡状态(见表4-1和图11)。表4-1结肠黏液中α-msh的浓度(pg/ml)table4-1concentrationofα-mshincolonmucinous注：***p＜0.001与pdg7经较，n＝5。6.3.3结肠组织中mpo活性在用导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株处理七天后，用elisa检测组织中的mpo的活性，结果发现与dss组相比，pdg7组和pbdmsh组的mpo的活性都得有效到下降，存在显著差异(p＜0.05)，但pbdmsh组更显著(p＜0.01)，见表4-2和图12。表4-2结肠组织中mpo的活性table4-2mpoactivityinthecolontissue注：*p＜0.05与dss组比较，**p＜0.01与pdg7、dss组比较，n＝5。6.3.4结肠组织细胞因子tnf-α、il-1β、il-6和il-10表达水平在服用长导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株七天后，细胞因子il-1β、tnf-α、il-6和il-10的表达出现了巨大变化。在pdg7组，相比于dss组，前炎症因子tnf-α和il-6都能有效下降(p＜0.05)，抗炎细胞因子il-10明显上升(p＜0.05)。相对dss组和pdg7组，pbdmsh组中的前炎症因子tnf-α，il-1β，il-6都显著降低(p＜0.05)，而il-6更加显著(p＜0.01)，抗炎细胞因子il-10也显著增加(p＜0.05)，见表4-3和图13。表4-3结肠组织中细胞因子il-1β、tnf-α、il-6和il-10表达table4-3expressionofcytokinesil-1β，tnf-α，il-6andil-10inthecolontissue注：*p＜0.05与pdg7、dss组比较，**p＜0.01与pdg7、dss组比较，#p＜0.05与dss组比较，n＝5。6.3.5小鼠结肠组织切片观察图14所示，经过苏木精-伊红染染色后，在正常组(n组)，我们可以看到完整的结肠黏膜层，有清晰的刷状缘，表层柱状细胞的排列紧密有序，没有任何破碎的迹象；在dss组，可以看到糜烂的黏膜，刷状缘遭到毁坏，已经分辨不出来，看不到表层的柱状细胞，柱状细胞下也没有看到明显的分层，表明严重的炎症细胞侵润和典型的溃疡；在空载体组(pdg7组)，观察到破碎的刷状缘，还能看到模糊的表层柱状细胞，柱状细胞细胞之间还能看到像气泡一样的白色细胞间隙；在表达α-msh的重组菌组(pbdmsh组)，能看到相对清晰的刷状缘，表面呈锯齿状，表层的柱状细胞也能也比较清晰，但是排列杂乱，柱状细胞下面分层明白。溃疡性结肠炎(uc)，作为一种复杂的炎性肠病，虽然经历了几十年研究，但真正病因至今不明。当今的治疗方法主要是使用抗炎药糖皮质激素、氨基水杨酸类药物以及免疫抑制剂等，还不能根本解决问题。在我们的实验中，我们试验以导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株作为转运载体，将抗炎多肽α-msh传递到结肠，研究携带α-msh导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株对结肠炎的抗炎效果。uc的首要表现为一系列炎症细胞因子的异常表达，对机体造成伤害，因此抑制炎症就成为治疗该病的第一要务。α-msh是一种人体内源性神经性多肽，对人体亲和力好，有很强的抗炎作用，能调节各种各样的炎症媒介因子，适用于这种具有复杂炎症背景的疾病，有报道证实，将该多肽注射到炎性肠病模型小鼠体内，可以起到很好的治疗效果，但这一试验存在很大问题。首先，α-msh的半衰期仅20分钟，注射仅能维持短时间内的疗效，不能应用于实际；另一方面，α-msh具有抑制致病菌如金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的作用，对于该类细菌引起炎性肠病，注射显然不能使α-msh作用于有害细菌，因此是一种非常不理智的方式，再者，α-msh为多肽，口服就也不现实。为了改变这种尴尬的情况，我们尝试通过口服表达α-msh导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株这么一个形式来利用α-msh。导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株主要生长在结肠，可以避免胃和小肠内的蛋白酶对α-msh的降解，通过导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株不断在结肠的分泌α-msh，来实现持续的给药，以维持有效浓度，达到治疗效果；同时，可以使α-msh直接作用于某些致病菌，这对炎性肠病非常重要，因为多数抗炎药只有抗炎效果，而没有抑制病菌的功能。从药物传递来说，导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株定植在结肠，此处也是结肠炎发作的部位，通过导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株运载，α-msh就可以直接靶向炎症组织，提高药物的利用率。小鼠结肠炎模型的结果表明，服用表达α-msh前体蛋白菌株，α-msh前体蛋白能够在结肠有效分泌，在结肠组织弗林蛋白酶的作用下转化为α-msh。在服用后的5-7天，α-msh在结肠粘液的量达到一个平稳状态，并且在有效浓度之内，表现出了一个持续的给药的效果。我们的数据表明，一个炎症状态和组织损伤的标志因子mpo，在服用表达α-msh的菌株后，其活性大大降低；前炎症因子il-1β,tnf-α和il-6则是显著降低，还有抗炎细胞因子il-10，被认为具有潜在治疗炎性肠病的蛋白，也得到显著增加，说明了一个良好的抗炎效应，后面的结肠组织病理切片观察也印证了我们的结果。我们的实验改变了α-msh多肽这种注射使用方式，实现口服传递α-msh，解决了它半衰期短的问题。在另一方面，炎症性肠病的治疗仅仅专注于控制炎症是远远不够的，因为此病还与肠道菌群紊乱有关，合理治疗应当还包括调节肠道菌群在内。有研究报道，一些细菌如大肠杆菌和禽结核分枝杆菌等致病菌在炎性肠病病人肠道内显著增加，分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、衣原体以及肠杆菌科细菌都能引起炎性肠病。因此，控制致病菌在治疗炎性肠病就显得理所当然。导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株作为益生菌，除了一些保健功能外，还能对消化道黏膜起屏障作用，抑制致病菌生长，维持肠道菌群平衡，还有一些研究表明导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株可用于控制炎性肠病，可能是与其抗菌功能有关，因此适用于炎性肠病。更有研究表明，导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株的数量在溃疡性结肠炎的病人的结肠中是减少的，补充导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株就显得非常有必要。综上所述，口服表达α-msh的导入α-msh多肽的粘红酵母重组菌株菌株可作为一种结合抗炎和肠道菌群调节治疗炎性肠病的有效手段α-msh是一种人体内源性神经性多肽，我们尝试用酵母在做为其运载体而进行口服，经过前面的菌株构建，已成功使α-msh进入胞内并且显示其位于油滴内，通过本章的实验发现，小鼠口服携带α-msh的菌株gm4-d6d-αmsh后，α-msh的含量在血清和重要器官组织中含量显著增高，改变了α-msh的给药方法，解决了半衰期短的问题。并且通过组织分布实验发现α-msh在肝脏中的含量增加更为显著，因此有益于用来治疗肝脏疾病。gla作为多不饱和脂肪酸本身就具有抗菌、抗炎的作用，而且也有多方面的保健作用。我们通过在粘红酵母中过表达d6d实现gla的过表达，而且不饱和脂肪酸大多是和甘油结合后生成三酰甘油储存在油滴中，那么我们本次实验就是实现了油滴中既富含gla，又含有α-msh，通过口服灭活的重组酵母，实现酵母对于两种抗炎物质的传递，同时该株粘红酵母经本实验室前期验证，其脂肪酸成分与植物油相似[10]，并且含有丰富的胡萝卜素，其成分有很好的保健作用。我们经实验发现，口服整个gm4-d6d-αmsh菌株后，不仅gla的含量增加了，而且gla的进一步产物花生四烯酸即ara的含量也增加了，实现了小鼠体内多种不饱和脂肪酸含量的增加。综上所述，口服整个富含gla和α-msh的酵母可以简单、有效的实现两种物质口服传递，那么这种方法也适用于做为其他多肽药物或者疏水药物的口服传递。通过小鼠口服gm4-d6d-αmsh菌株后，血清以及肝、肺、肾、脾中α-msh的浓度增加，在重要组织器官中，肝中的α-msh的浓度增加更为显著；小鼠口服gm4-d6d-αmsh菌株后，血清和肝的gla、ara的浓度增加。本发明以粘红酵母做为载体，通过过表达d6d提高菌株gla的含量，并通过电穿孔实现外源多肽α-msh和h22lp进入胞内油滴中，并经健康小鼠口服整个酵母菌株gm4-d6d-αmsh评价该方法口服传递α-msh和gla的效果，具体结果总结如下：(1)通过构建外源基因d6d的表达载体ppgk1-rd-d6d，实现δ6-去饱和酶基因在粘红酵母中的稳定遗传，并实现d6d的过表达，使重组菌株中的gla含量较野生菌株提高了3.3倍多。(2)通过电穿孔方法，实现外源多肽进入胞内，通过激光共聚焦发现进入胞内的多肽位于油滴内；并且此方法适用于两种不同的多肽α-msh和h22lp，两种多肽进入胞内的含量没有明显差异。(3)口服整个携带gla和α-msh的菌株gm4-d6d-αmsh，发现小鼠血清和重要器官(肝、肺、脾、肾)中α-msh的含量增加，特别是肝脏提高了3.24倍；血清和肝中的gla和gla的下一步产物ara的含量也得到了提高，其中血液中gla含量提高了约7.26倍，花生四烯酸提高了约1.55倍；肝脏中gla含量较提高了约4.33倍，花生四烯酸提高了约1.28倍。酵母既有单细胞微生物的特点，如酵母本身较小只有几微米、容易培养、细胞生长快等，也有真核细胞所具有的特点，如可以进行真核细胞的转录后翻译、没有内毒素等，而且到目前为止已经将酵母在遗传学和结构上的特点研究的较为清楚，利于进行基因修饰，构建工程菌，同时酵母可实现工业化大规模生产，目前已有关于酵母的产品上市。酵母充当载体，通过口服整个酵母来实现不饱和脂肪酸的传递已有报道，我们实验的独特之处是可同时运载不饱和脂肪酸和多肽药物，酵母特殊的细胞壁结构，使得其对消化道的胃酸有较强的抵抗作用，能作为一种天然的生物胶囊为生物大分子提供良好的保护，保护不饱和脂肪不被氧化，保护多肽药物不被酶降解。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12