钙网蛋白基因1型突变检测用封闭PNA探针的制作方法

本发明涉及钙网蛋白基因1型突变检测领域，具体涉及一种钙网蛋白基因(calr基因)1型突变检测用封闭pna探针。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(mpn)是骨髓中一种或多种髓系细胞增殖和外周血中成熟及不成熟细胞增加的克隆性造血干/祖细胞疾病。近年来，多个分子标志物，如jak2、mpl和tet突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解mpn的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。但是，有30％～45％的携有野生型jak2/mpl的原发性血小板增多症(et)或原发性骨髓纤维化(pmf)患者仍然存在诊断困难，新近报道的钙网蛋白基因(calr)突变将能部分填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。

calr是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、凋亡、黏附、免疫等过程。calr基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子和9个蛋白结构域，calr基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(kdel氨基酸序列)的新型的c-羧基末端的蛋白，到目前为止，已经检测到多于40种不同的calr突变体，其中最常见的两种变异体分别为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.l367fs*46)和由5个碱基ttgtc插入引起的2型变异体(p.k385fs*47)，它们分别占所有突变体的53％和32％，研究者在体外实验中发现，过度表达的1型突变体增强了白介素-3表达，也促进了stat5磷酸化作用并且引起信号传导的激活，这种激活作用能被jak抑制剂阻滞，这说明calr和jak2突变可能有类似的机制。

当前calr基因1型突变的检测主要依赖于探针实时pcr法或测序法等，然而，由于calr基因1型变异所在的区段碱基重复序列多、ga含量高，导致所设计出的检测体系特异性差，检测效果不够理想。肽核酸(peptidenucleicacid，pna)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨架的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)类似物，它能够与dna和rna特异性地结合从而可以制备pna探针，与dna探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加且能在低盐浓度下进行杂交，因此它能够大大提高检测的效率和灵敏度，pna独特的生化属性已逐渐为世人所瞩目.pna探针技术也得到了迅速发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种钙网蛋白基因1型突变检测用封闭pna探针。具体而言，本发明针对calr基因1型突变进行特异性检测的pcr体系设计了一段肽核酸序列，作为封闭探针，用于对扩增体系中的非特异性核酸序列(即非1型突变的核酸序列)进行封闭，可以大大提高pcr检测的特异性(实时pcr或环介导等温扩增法等)。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种calr基因1型突变检测用pna探针，所述pna探针包含seqidno.1所示的序列。

优选的，所述pna探针的序列为aagaagacaagaaacg-kk。(16nt，末端加2个赖氨酸，增加亲水性)

本发明还涉及一种calr基因1型突变检测用引物，所述引物用于扩增calr基因1型突变靶序列；包括如seqidno.4，seqidno.5所示的引物对，以及如seqidno.6，seqidno.7所示的引物对。所述calr基因1型突变检测是引入本发明的包含seqidno.1所示的序列的pna探针进行的突变检测。

优选的，所述calr基因1型突变靶序列如seqidno.3所示。

本发明还涉及一种calr基因1型突变检测用试剂盒，所述试剂盒包括：所述calr基因1型突变检测用pna探针和calr基因1型突变检测用引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明的肽核酸封闭探针可以大幅提高calr基因1型突变检测体系的特异性；

2)当前的calr基因1型突变检测方法以实时pcr法和测序法为主，虽然这两种方法均有较高的灵敏度和特异性，但这两种方法所需的设备价格昂贵、对检测平台和技术人员业务水平要求也高，难以在基层医疗单位普及，且以上检测方法的报告周期较长(通常为1-5个工作日)，患者病情容易被延误，不利于精准医疗的实现，而本发明中所提出的检测方案-在环介导等温扩增的基础上引入pna探针，使该检测体系具有与实时pcr法相当的灵敏度和特异性，又可以大大缩短患者的报告周期(该方法1小时内即可完成准确检测)，且该方法对设备和技术人员的要求较低，为将来calr基因1型突变床旁快速检测的实现奠定了初步的方法学基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为calr基因1型突变lamp体系特异性的验证对比图；其中，b1：临床calr-2突变阳性基因组dna，b2：临床calr-1突变阳性基因组dna，b3：临床calr野生型基因组dna，b4：calr-1突变阳性质粒，b5：calr-1突变阳性质粒，b6：calr野生型质粒，b7：空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、pna探针的设计

通过软件分析calr基因1型突变所确实的52nt的序列(1gcagaggcttaaggaggaggaagaagacaagaaacgcaaagaggaggaggag52seqidno.2)，经筛选发现：特异性较强的区域序列为：21aagaagacaagaaacg36seqidno.1，因此，将该序列设计合成为肽核酸，同时由于ag含量太高不利于溶解，于是在末端加了2个赖氨酸增加亲水性，因此所得到的最终肽核酸封闭探针为calr-1pna：aagaagacaagaaacg-kk，经验证，该序列确实可以大幅提高calr基因1型突变检测体系的特异性。

实施例2、pna探针的特异性验证

在calr基因1型突变的位置周围选定检测的靶片段，利用在线的lamp引物设计网站primerexplorerv5(https：//primerexplorer.jp/lampv5/index.html)针对靶片段，设计适当的特异性引物：

(1)引物序列为：

f3：gccctgaggtgtgtgcseqidno.4，

b3：tttggcgcggccagcseqidno.5，

fip：tctttgtcctcatcatcctccttgtgcaggcagcagagaaacseqidno.6，

bip：gccaggccaaggacgacaggcctcagtccagcseqidno.7；

(2)肽核酸封闭探针pna序列：aagaagacaagaaacgseqidno.1(16nt，末端加了2个赖氨酸，增加亲水性)。

(3)靶序列，具体为：

gccctgaggtgtgtgctctgcctgcaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggacaaggaggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggaggacaaggaggaagatgaggaggaagatgtccccggccaggccaaggacgagctgtagagaggcctgcctccagggctggactgaggcctgagcgctcctgccgcagagctggccgcgccaaa(241bp)seqidno.3：

(4)所用的扩增总体积为25μl，2×反应缓冲液(rm)12.5μl，引物f3：1μl(终浓度0.2μmol/l)，引物b3：1μl(终浓度0.2μmol/l)，引物：fip1μl(终浓度1.6μmol/l)，引物bip：1μl(终浓度1.6μmol/l)，pna：1μl(终浓度0.8μmol/l)，bstdna聚合酶1μl(8u)，钙黄绿素(fd)1μl，去离子水3.5μl，模板2μl。lamp反应条件为：65℃，60min；所用的设备为普通pcr仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备；结果判断：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为绿色，即判定为反应阳性。

图1为calr基因1型突变lamp体系特异性的验证对比图；b1：临床calr-2突变阳性基因组dna，b2：临床calr-1突变阳性基因组dna，b3：临床calr野生型基因组dna，b4：calr-1突变阳性质粒，b5：calr-1突变阳性质粒，b6：calr野生型质粒，b7：空白对照，由图1可知，该检测体系仅对calr-1突变的靶片段进行扩增，而对非calr-1突变的靶片段或空白对照体系中均无任何的非特异性扩增，表明该检测体系具有良好的特异性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

sequencelisting

<110>曹国君

<120>钙网蛋白基因1型突变检测用封闭pna探针

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