一种人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学临床检测
技术领域：
，具体涉及一种人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
肝纤维化是指肝细胞受到炎症刺激或发生坏死时，细胞外基质的增生与降解失去平衡，进而导致肝内结缔组织异常沉积的病理过程。原发性肝癌居常见恶性肿瘤的第五位，每年约超过60万人死于肝癌，在全球肿瘤相关性死亡中排名第三，我国患肝癌病例占全球的50％以上，对于肝癌的及时诊断和治疗对于提高患者生存率具有重要意义。肝纤维化过程涉及多种细胞和细胞因子，形成一个复杂的网络系统调控肝纤维化的发生和发展。促纤维化因子tnf-α被认为是炎症相关性肿瘤中最重要的细胞因子，多项研究证明其参与肝损伤、肝纤维化及肝癌病理的发生发展过程。研究表明tnf-α基因启动子snp(包括-1031、-863、-857、-376、-308、-238)可影响tnf-α的表达。大多研究表明tnf-α-308(g>a)与肝癌遗传易感性有关，具有临床检测意义，当-308位点g被a替换后，tnf-α的转录效率会增加6～7倍，使tnf-α的表达量显著上升。tnf-α-308(g>a)的snp编号为rs1800629，位于tnf-α的启动子区域。ncbi各个文献中关于rs1800629等位基因人口多样性中统计数据显示亚洲人a等位基因基因型占比2.2～14.6％。文献表明广西壮族人群中正常对照组中a等位基因占比6.16％，而hcc患者占比17.16％，携带tnf-α-308a等位基因的个体患hcc的风险是携带g等位基因个体的3.153倍。该高频snp的检测对于原发性肝癌的检测有重要价值。目前针对snp检测的常用方法有很多种，包括pcr-直接测序法、pcr-焦磷酸测序法、pcr-基因芯片法、pcr-电泳分析、pcr-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性pcr法、pcr-限制性片段长度多态性方法、荧光定量pcr法、巢式pcr-探针法、原位杂交(ish)等。最为常见的方法是测序法，该方法费用低，但耗时长、灵敏度不高；高分辨率熔解曲线法对设备要求比较高，不利于临床推广；传统的荧光pcr法在临床上应用较为广泛，但检测微量灵敏度不高。因此，我们建立一种操作方便、成本不高、较高灵敏度的荧光pcr法检测肝纤维化、肝癌风险基因的多态性。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种用于人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测的引物及pna组，所述引物及pna组包括序列如seqidno.1所示的正向引物、序列如seqidno.2所示的反向引物、序列如seqidno.3所示且5’端携带vic荧光基团的鉴定引物、序列如seqidno.4所示且5’端携带fam荧光基团的鉴定引物、序列如seqidno.5所示且3’端携带bhq淬灭基团的pna、序列如seqidno.6所示且3’端携带bhq淬灭基团的pna、序列如seqidno.7所示的内参正向引物、序列如seqidno.8所示的内参反向引物、序列如seqidno.9所示且5’端携带rox荧光基团的内参鉴定引物、序列如seqidno.10所示且3’端携带bhq淬灭基团的内参pna。一种人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒，包括检测试剂、阳性对照品和阴性对照品；所述检测试剂包含：序列如seqidno.1所示的正向引物、序列如seqidno.2所示的反向引物、序列如seqidno.3所示且5’端携带vic荧光基团的鉴定引物、序列如seqidno.4所示且5’端携带fam荧光基团的鉴定引物、序列如seqidno.5所示且3’端携带bhq淬灭基团的pna、序列如seqidno.6所示且3’端携带bhq淬灭基团的pna、序列如seqidno.7所示的内参正向引物、序列如seqidno.8所示的内参反向引物、序列如seqidno.9所示且5’端携带rox荧光基团的内参鉴定引物、序列如seqidno.10所示且3’端携带bhq淬灭基团的内参pna、以及pcr反应液；所述阳性对照品包含：含tnf-α基因rs1800629-g、tnf-α基因rs1800629-a的重组质粒和含内参基因的重组质粒的混合物；所述阴性对照为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒。上述方案中，所述检测试剂中，序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.7、seqidno.8所述引物的浓度为100～400nm，序列如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.9所述引物的浓度为50～100nm，序列如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.10所述pna的浓度为50～100nm。上述方案中，所述pcr反应液包括premixqpcrmix以及te缓冲液。上述方案中，所述阴性对照品为puc-19质粒空载体。上述人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒在制备用于人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测产品中的应用。所述试剂盒的具体使用方法包括如下步骤：(1)采用基因组dna提取试剂盒提取待测人外周血的基因组dna作为待检测样本；(2)荧光定量检测：向反应管中加入待检测样本和检测试剂，同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光pcr仪进行pcr扩增反应，并采集fam、vic和rox荧光信号；(3)pcr扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本dna稀释到浓度为0.1～100ng/μl，再进行pcr扩增反应。上述方案中，步骤(2)所述pcr扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，采集荧光。上述方案中，步骤(3)所述结果判定的准则为：①当阳性对照均有fam、vic、rox荧光信号起线，阴性对照均无fam、vic、rox荧光起线，检测样本有rox荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的fam、vic荧光信号判断tnf-α基因rs1800629的分型：vic荧光信号起线，tnf-α基因rs1800629分型为纯合野生型；fam荧光信号起线，tnf-α基因rs1800629分型为杂合突变型；vic、fam荧光信号均起线，tnf-α基因rs1800629分型为纯合突变型。本发明试剂盒是基于arms-pna-荧光定量pcr方法的基因多态性试剂盒，其技术原理如图1所示。本试剂盒所述检测试剂中包含2对普通扩增引物，3个带有荧光基团的鉴定引物，3个与鉴定引物配对的pna序列。针对待检测基因的两条鉴定引物3’端为待测snp位点碱基，5’端标记荧光基团，其中突变引物标记fam荧光基团，野生引物标记vic荧光基团。另外，内参基因的鉴定引物5’端标记rox荧光基团。pna(peptidenucleicacids，肽核酸)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物，可以通过碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构，当pna与互补dna完全匹配时，因其pna为肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键能够阻止dna扩增。pna序列3’端标记淬灭基团bhq，能够与鉴定引物匹配使未与模板链结合的鉴定引物无法释放荧光信号。扩增反应发生时，普通扩增引物将含有snp位点的序列从基因组dna中扩增出来，若鉴定引物脱离pna序列与模板链结合，则鉴定引物会释放荧光信号，随着扩增循环数的增加，越来越多的鉴定引物与模板链结合，荧光信号逐渐放大；若鉴定引物与模板链不匹配则会与pna序列保持配对无法释放荧光。同理，检测内参的鉴定引物会在反应中释放rox荧光信号。最终检测结果中纯合野生型基因型呈现vic和rox荧光起线，纯合突变型基因型呈现fam和rox荧光起线，杂合型基因型呈现fam、vic和rox荧光起线。本发明的有益效果如下：(1)本发明所述试剂盒能够快速定性检测tnf-α基因多态性，直接通过荧光线形判断结果，能够快速灵敏地检测待测位点基因类型，从而准确对人类tnf-α基因多态性进行基因分型；采用特异性荧光标记的鉴定引物、在一个pcr孔内、进行一个pcr反应即可完成基因的分型检测(不需要分孔分别进行突变、野生或内参的检测)，实现了每个基因的多态性分型只需通过一个多重pcr反应即可完成检测，大大降低了检测成本，提高了检测效率；(2)本发明所述试剂盒的检测试剂是配制完成的成品，只需要加入待测样本即可进行pcr荧光反应，既节省了检测时间又提高了检测效率；同时本发明所述检测试剂中还含有内参基因引物，通过检测内参基因，可以使样本提取导致的假阴性和假阳性问题得以有效避免，保证检测结果的准确性；(3)本发明所述试剂盒中通过携带荧光基团和标签序列的特异性鉴定引物可以被携带淬灭基团的pna结合从而使荧光处于淬灭状态，在pcr反应过程中，携带荧光基团的鉴定引物与待检测基因模板特异性结合后释放荧光生成荧光曲线进行结果判读；利用携带荧光的特异性鉴定引物结合携带淬灭基团的pna、内控引物、内控鉴定引物、内控pna，大大提高了基因分型的特异性和准确性，操作简便、结果可靠，能在1小时内完成检测分型；(4)本发明所述试剂盒中含有2对普通扩增引物，能将含有snp位点的序列从基因组dna中扩增出来并进一步富集，可以大大提高分型效率，进而可以检测到更低浓度的基因组样本，本发明所述试剂盒最低可对0.1ng基因组dna进行多态性检测；(5)本发明所述试剂盒适用于普通荧光pcr仪，具有灵敏度和特异性高、假阳性低等优点，同时价格低廉、经济简便，利于医院临床上的应用推广。附图说明图1为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。图2为本发明所述试剂盒最低检测限(0.1ng/μl)的检测结果扩增曲线。图3为利用本发明所述试剂盒对tnf-α基因rs1800629纯合野生型扩增曲线。图4为利用本发明所述试剂盒对tnf-α基因rs1800629杂合突变型扩增曲线。图5为利用本发明所述试剂盒对tnf-α基因rs1800629纯合突变型扩增曲线。图6为实施例4中tnf-α基因rs1800629位点纯合野生样本的检测结果图。图7为实施例4中tnf-α基因rs1800629位点杂合突变样本的检测结果图。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1一种用于快速检测人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α基因多态性的试剂盒，检测试剂针对tnf-α基因的rs1800629多态性位点，检测试剂包含：序列为seqidno.1的正向引物、序列为seqidno.2的反向引物、序列为seqidno.3的鉴定引物(5’端携带vic荧光基团)、序列为seqidno.4的鉴定引物(5’端携带fam荧光基团)、序列为seqidno.5的pna(3’端携带bhq淬灭基团)、序列为seqidno.6的pna(3’端携带bhq淬灭基团)、序列为seqidno.7的内参正向引物、序列为seqidno.8的内参反向引物、序列为seqidno.9的内参鉴定引物(5’端携带rox荧光基团)、序列为seqidno.10的内参pna(3’端携带bhq淬灭基团)、pcr反应液(premixqpcrmix以及te缓冲液)。除上述检测试剂，试剂盒还包括1个阳性对照品和1个阴性对照品，阳性参考品为包含tnf-α基因rs1800629(g)、tnf-α基因rs1800629(a)的重组质粒和包含内参基因的重组质粒的混合物，阴性对照品为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒。用于tnf-α基因rs1800629位点检测的引物和pna序列，seqidno.1与seqidno.2扩增产物为139bp，seqidno.3与seqidno.2扩增产物为72bp，seqidno.4与seqidno.1扩增产物为105bp，seqidno.7与seqidno.8扩增产物为138bp，seqidno.9与seqidno.8扩增产物为119bp。上游扩增引物seqidno.1：5’-tcctgcatcctgtctggaag-3’下游扩增引物seqidno.2：5’-caagcatcaaggatacccct-3’野生鉴定引物seqidno.3：5’-vic-ataggttttgaggggcatgg-3’突变鉴定引物seqidno.4：5’-fam-gaggctgaaccccgtcct-3’野生pna序列seqidno.5：5’-ccatgcccctcaaaacctat-bhq-3’突变pna序列seqidno.6：5’-gggacggggttcagcctc-bhq-3’内参上游引物seqidno.7：5’-cgggacctgactgactacct-3’内参下游引物seqidno.8：5’-ggccatctcttgctcgaagt-3’内参鉴定引物seqidno.9：5’-rox-tccagggcgacgtagcacag-3’内参pna序列seqidno.10：5’-ctgtgctacgtcgccctgga-bhq-3’所述人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒的检测试剂中还包括pcr反应液(premixqpcrmix以及te缓冲液)。除上述检测试剂，试剂盒还包括1个阳性对照品和1个阴性对照品，阳性对照品为包含tnf-α基因rs1800629(g)、tnf-α基因rs1800629(a)的重组质粒和包含内参基因的重组质粒的混合物，阴性对照品为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒(puc-19质粒空载体)。以上载体序列为本领域人员所熟知，此处不列举详细序列。实施例2一种人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒，包括检测试剂、阳性对照和阴性对照；所述检测试剂的各组成成分如下表1，所述试剂盒的组成由表2所示：表1检测试剂组成组分配比premixqpcrmix25μlseqidno.1100～400nmseqidno.2100～400nmseqidno.350～100nmseqidno.450～100nmseqidno.550～100nmseqidno.650～100nmseqidno.7100～400nmseqidno.8100～400nmseqidno.950～100nmseqidno.1050～100nmte缓冲液补足至30μl表2试剂盒组成实施例3使用实施例2制备的试剂盒检测样品的的最低检测限，具体包括如下操作步骤：(1)使用天根生化生物技术公司全血dna提取试剂盒提取5个人类外周血基因组dna，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，得到人类基因组dna待检测样本，将样本稀释至2ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl、0.05ng/μl。(2)取pcr八连管，分别在孔中加入20μl梯度稀释的样本；每个孔中加入混合均匀的检测试剂30μl；将八连管震荡离心混匀反应液；(3)将八连管放入abi7500荧光pcr仪中，进行扩增检测，pcr反应条件如表3：表3pcr反应程序(4)分析结果：分析5个样本的4个浓度梯度检测结果：2～0.1ng/μl均能正确判读且ct值≤17(试剂盒检测标准之一)，3个样本的0.05ng/μl可以正确判读但ct值>17。重复检测20例样本0.1ng/μl均能正常分型且符合检测标准，将最低检测限定为0.1ng/μl(检测图结果如图2所示)。实施例4使用实施例2制备的试剂盒检测待测样品，具体包括如下操作步骤：(1)使用天根生化生物技术公司全血dna提取试剂盒提取120个人类外周血基因组dna，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，得到人类基因组dna待检测样本(0.1～100ng/μl)；(2)取pcr八连管，分别在孔中加入2μl待检测样本，一孔中加入2μl阳性对照品，一孔中加入2μl阴性对照品，补充18μl的ddh2o至20μl；每个孔中加入混合均匀的检测试剂30μl；将八连管震荡离心混匀反应液；(3)将八连管放入abi7500荧光pcr仪中，进行扩增检测，pcr反应条件如表3；(4)分析结果：参考结果判读表(如表4所示)和结果判读参考图(如图3～5所示)，判读120个样本的基因型；tnf-αrs1800629位点纯合野生样本111个，检测结果如图6；tnf-αrs1800629位点杂合突变样本9个，检测结果如图7；tnf-αrs1800629位点没有检测到纯合突变样本；表4结果判读tnf-αrs1800629fam(-a)vic(-g)rox(内参)gg(纯合野生型)–++ag(杂合突变型)+++aa(纯合突变型)+–+上述120例样本荧光定量检测结果与测序结果100％一致。以上结果表明本试剂盒用于人类肝纤维化、肝癌风险基因多态性检测结果可靠。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。序列表<110>武汉康录生物技术股份有限公司<120>一种人类肝纤维化、肝癌风险基因tnf-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用<160>10<210>1<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞1tcctgcatcctgtctggaag20<210>2<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞2caagcatcaaggatacccct20<210>3<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞3ataggttttgaggggcatgg20<210>4<211>18bp<212>dna<213>人工序列＜400＞4gaggctgaaccccgtcct18<210>5<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞5ccatgcccctcaaaacctat20<210>6<211>18bp<212>dna<213>人工序列＜400＞6gggacggggttcagcctc18<210>7<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞7cgggacctgactgactacct20<210>8<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞8ggccatctcttgctcgaagt20<210>9<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞9tccagggcgacgtagcacag20<210>10<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞10ctgtgctacgtcgccctgga20当前第1页12