用液相芯片技术检测心血管疾病药物基因多态性的特异性引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及利用液相芯片技术检测常用心血管疾病药物基因多态性的特异性引物，本发明还涉及包含这些特异性引物的试剂盒及试剂盒使用方法。
背景技术：
心血管疾病是心脏和血管疾患引起的，包括冠心病(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、高血压(血压升高)、周围血管疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、心力衰竭以及心肌病。心血管疾病是一种严重威胁人类、特别是50岁以上中老年人健康的常见病。目前，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为45.01％，城市为42.61％。据统计，约三分之一并非死于疾病本身，而是死于不合理用药。心血管疾病精准个体化用药是安全用药的保障，使医生可以为患者个性化选择药物种类和用药剂量。临床常见的心血管疾病治疗药物包括氯吡格雷、华法林、硝酸甘油、阿司匹林等等。由于个体差异的存在，不同患者服用相同药物所获得的治疗效果不尽相同。越来越多的研究发现患者的遗传因素是影响药物代谢、吸收及排泄的重要因素，目前，已经检测出数十种酶在不同的个体中活性不甚相同，随着cyp2c9、vkorc1、cyp4f2、cyp2c19、pon1、cyp2d6、adrb1、aldh2、gp1ba、pear1、agtr1等与药物吸收、分布、代谢和排泄相关的重要基因的单个甘酸多态性(snp)被陆续发现，通过对各种心血管类药物靶位基因多态性的检测来决定药物的选择或使用剂量是至关重要的协助临床精准用药手段。cyp2c9基因、vkorc1基因及cyp4f2基因多态性与华法林个体化用药相关性华法林(warfarin)是香豆素类口服抗凝药，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一，但临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握。研究表明，维生素k环氧化物还原酶复合体亚单位i基因(vkorc1)的基因多态性和细胞色素p450基因(cyp2c9)是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素。此外，cyp4f2基因的多态性(rs2108622)也与华法林个体剂量差异相关。cyp2c19基因多态性与氯吡格雷个体化用药相关性氯吡格雷(clopidogrel)，为口服抗血小板药物，目前已经广泛应用于急性冠状动脉综合征(acs)和pci术后治疗，可以有效预防acs患者的缺血时间的发生。该药品经体内p450酶生物转化后可与血小板表面adp受体p2y12发生不可逆的结合，从而抑制adp诱导的血小板的聚集，达到抗凝血的功效。因此，细胞色素p450基因(cyp2c19)则是影响氯吡咯雷用量个体差异最主要的遗传因素。aldh2基因多态性与硝酸甘油的个体化用药相关性-aldh2是人体催化硝酸甘油生物转化的主要途径，该酶同时具有脱氢酶和酯酶的催化活性，其酯酶活性可以通过将硝酸甘油脱硝产生no，进而引起血管扩张。aldh2基因位于第12号染色体的12q24.2位置，全长43,438bp，共有13个外显子，编码由517个氨基酸残基组成的多肽，由于遗传，在人群中该酶基因型出现3种情况，具有正常催化活性纯合子型：aldh2*1/*1；催化活性下降的杂合子型：aldh2*2/*1；催化活性失去的纯合子型：aldh2*2/*2。近几年研究显示aldh2能够改善心力衰竭的预后、保护心肌缺血再灌注损伤，基因突变后造成酶活性下降，增加冠心病(cad)和心肌梗死(mi)的风险。cyp2d6、adrb1、pon1、gp1ba、pear1、agtr1基因的多态性与心血管疾病药物的相关性cyp2d6和adrb1基因的多态性与β受体阻断药的疗效有关，pon1基因的多态性(rs662)与氯吡格雷的疗效或不良反应有关，gp1ba基因的多态性(rs2243093)与阿司匹林抗血小板的药效相关，pear1与阿司匹林抵抗及预后有关，agtr1基因的多态性(rs5186)与高血压具有相关性。现有技术中往往采用pcr-直接测序法、pcr-焦磷酸测序法、荧光定量pcr法、pcr-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性pcr法、pcr-限制性片段长度多态性方法及固体芯片法等来检测一种或几种心血管类药物相关基因的多态性，这些方法大都灵活度低，成本高，通量低，时间较长，检测仪器昂贵，不适合临床推广，每人一次检查的试剂成本即达数十到数百美元，且已有的检测试剂盒不针对中国人遗传病疾病谱。因此，对同时或并行地特异性检测多种心血管类药物相关基因多态性的产品存在极大的需求。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的发明人将luminex液相芯片技术与等位基因特异性引物延伸(allelespecificprimerextension，aspe)反应相结合，设计并构建含有cyp2c9、vkorc1、cyp4f2、cyp2c19、pon1、cyp2d6、adrb1、aldh2、gp1ba、pear1、agtr1基因突变位点的模拟样本，建立了一种可同时检测心血管类药物相关基因多态性的新型检测方法。本发明的第一方面提供了一种用液相芯片技术同时检测15种心血管类药物相关靶基因多态性的引物组，包括15组引物，其中每组引物包括用于检测一种靶基因多态性的一对特异性扩增引物以及分别针对所述靶基因的野生型和突变型的两条aspe引物；所检测的靶基因多态性分别为：cyp2c9-c430trs1799853、cyp2c9-a1075crs1057910、vkorc1-g1639ars9923231、cyp4f2-c1347trs2108622、cyp2c19-g681ars4244285、cyp2c19-g636ars4986893、cyp2c19-c806trs12248560、pon1-q192rrs662、cyp2d6-c2850trs16947、cyp2d6-c100trs1065852、adrb1-g1165crs1801253、aldh2-g504ars671、gp1ba-t5crs2243093、pear1g＞ars2768759和agtr1-a1166crs5186；用于检测所述靶基因的位点多态性的引物组的序列如下所示：用于检测cyp2c9-c430trs1799853的特异性扩增引物如序列seqidno.1和seqidno.2所示，其aspe引物如序列seqidno.3和序列seqidno.4所示；用于检测cyp2c9-a1075crs1057910的特异性扩增引物如序列seqidno.5和seqidno.6所示，其aspe引物如序列seqidno.7和序列seqidno.8所示；用于检测vkorc1-g1639ars9923231的特异性扩增引物如序列seqidno.9和seqidno.10所示，其aspe引物如序列seqidno.11和序列seqidno.12所示；用于检测cyp4f2-c1347trs2108622的特异性扩增引物如序列seqidno.13和seqidno.14所示，其aspe引物如序列seqidno.15和序列seqidno.16所示；用于检测cyp2c19-g681ars4244285的特异性扩增引物如序列seqidno.17和seqidno.18所示，其aspe引物如序列seqidno.19和序列seqidno.20所示；用于检测cyp2c19-g636ars4986893的特异性扩增引物如序列seqidno.21和seqidno.22所示，其aspe引物如序列seqidno.23和序列seqidno.24所示；用于检测cyp2c19-c806trs12248560的特异性扩增引物如序列seqidno.25和seqidno.26所示，其aspe引物如序列seqidno.27和序列seqidno.28所示；用于检测pon1-q192r(a/g)rs662的特异性扩增引物如序列seqidno.29和seqidno.30所示，其aspe引物如序列seqidno.31和序列seqidno.32所示；用于检测cyp2d6-c2850trs16947的特异性扩增引物如序列seqidno.33和seqidno.34所示，其aspe引物如序列seqidno.35和序列seqidno.36所示；用于检测cyp2d6-c100trs1065852的特异性扩增引物如序列seqidno.37和seqidno.38所示，其aspe引物如序列seqidno.39和序列seqidno.40所示；用于检测adrb1-g1165crs1801253的特异性扩增引物如序列seqidno.41和seqidno.42所示，其aspe引物如序列seqidno.43和序列seqidno.44所示；用于检测aldh2-g504ars671的特异性扩增引物如序列seqidno.45和seqidno.46所示，其aspe引物如序列seqidno.47和序列seqidno.48所示；用于检测gp1ba-t5crs2243093的特异性扩增引物如序列seqidno.49和seqidno.50所示，其aspe引物如序列seqidno.51和序列seqidno.52所示；用于检测pear1g＞ars2768759的特异性扩增引物如序列seqidno.53和seqidno.54所示，其aspe引物如序列seqidno.55和序列seqidno.56所示；用于检测agtr1-a1166crs5186的特异性扩增引物如序列seqidno.57和seqidno.58所示，其aspe引物如序列seqidno.59和序列seqidno.60所示。在本发明的一优选实施方式中，所述aspe引物包括位于5’端的tag序列和位于3’端的针对靶基因多态性的特异性引物序列两部分，并且所述aspe引物的3′末端第一个碱基与待检测的靶基因互补配对。在本发明的另一优选实施方式中，所述aspe引物中包括的特异性引物序列如序列seqidno.61-90所示。本发明的第二方面提供了上述的引物组在制备利用液相芯片技术同时检测15种心血管类药物相关靶基因多态性的试剂盒中的用途。本发明的第三方面提供了一种利用液相芯片技术同时检测多个心血管类药物相关靶基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和30种微球，其中，所述引物组包括15组引物，每组引物包括用于检测一种靶基因多态性的一对特异性扩增引物以及分别针对所述靶基因的野生型和突变型的两条aspe引物，所述aspe引物包括位于5’端的tag序列和位于3’端的针对靶基因的特异性引物序列两部分，并且所述aspe引物的3′末端第一个碱基与待检测的靶基因互补配对；和每种微球各自偶合一种分别与所述aspe引物的tag序列互补配对的寻址探针序列。在本发明的一优选实施方式中，本发明的试剂盒还包括链霉亲和素-藻红蛋白杂交缓冲液、pcr反应液、dna聚合酶和阴性对照。在本发明的另一优选实施方式中，本发明的试剂盒中的aspe引物中包括的位于3’端的特异性引物序列如序列seqidno.61-90所示。在本发明的又一优选实施方式中，本发明的试剂盒中的阴性对照为蒸馏水+微球。本发明的第三方面提供了一种使用本发明的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)多重pcr扩增反应：提取样品中的dna作为模板，利用试剂盒中的特异性扩增引物配制多重pcr反应体系，在设定的pcr扩增程序下进行pcr扩增；(2)pcr产物的纯化：用外切酶和碱性磷酸酶消化pcr产物中多余的dntp、引物及单链产物；(3)aspe反应：纯化后的pcr产物在设计的aspe反应程序下，在aspe反应体系中dna聚合酶的作用下，当引物3′末端第一个碱基与扩增的靶序列检测位点互补时，进行延伸反应，如果不互补，延伸反应将终止；(4)杂交反应：取25μl稀释的微球至96孔杂交板，对照孔加入等量的微球和去离子水，加入步骤(3)的aspe反应产物2.5μl，吸打均匀，杂交反应条件为96℃变性90s，37℃孵育30min；(5)结果检测：将杂交后的微球重新悬浮于100μl含有6.5μg/ml链霉亲和素-藻红蛋白的1×杂交缓冲液中，37℃孵育20min后，在luminex200仪器上进行检测。在本发明的一优选实施方式中，在步骤(1)中，多重pcr反应体系为：总体积50μl，gdna共50ng，2μl，10×pcr反应缓冲液5μl，taqtmhotstart酶0.25μl，dntp各2.5mm，共4μl，引物浓度为10μm，各0.5μl，去离子水30.75μl；pcr扩增反应的程序为：预变性：94℃30s，循环：94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，共5次，94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，共30次，终延伸：72℃10min；在步骤(3)中，aspe反应体系为：纯化后pcr产物2μl，10×pcr反应缓冲液5μl，400μm的biotin-dctp0.35μl，datp、dgtp、dttp各100μm，共1μl，100mm的dctp0.3μl，taqtmhotstart酶0.1μl，tag-aspe引物各500nm，共1μl，去离子水13.55μl；aspe延伸反应的程序为：预变性：94℃90s；循环：94℃30s，57℃30s，74℃1min，40次。本发明提供的引物和试剂盒利用液相芯片技术可以同时检测多种常见心血管类疾病药物相关基因，具有如下有益技术效果：1.本发明的液相芯片检测试剂盒包含15对特异性引物，并联合magplex微球在一步pcr反应中同时扩增并检测15种常见心血管类药物相关靶基因cyp2c9、vkorc1、cyp4f2、cyp2c19、pon1、cyp2d6、adrb1、aldh2、gp1ba、pear1、agtr1的多态性，检测通量高，性价比高，一次检测可提供心血管疾病患者的用药指导，为临床合理用药提供实验室依据，具有极大的临床应用价值。2.该试剂盒具有非常好的特异性，设计的引物、探针序列之间不存在交叉反应。3.该试剂盒在实际检测中具有非常好的灵敏度和稳定性。4.本发明的试剂盒操作步骤简单，15种突变位点可以通过pcr联合aspe反应同时检测，避免反复多次pcr操作过程中可能导致的样品污染，从而大大提高检测准确率。5.检测结果与测序结果吻合良好，能够准确地检测出心血管类药物相关靶基因多态性位点类型，且结果稳定可靠，与常规检测snp方法相比，大大降低了检测成本。附图说明下列附图用于说明本发明的具体实施方式，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的范围。图1中的图1a-1d显示液相芯片技术中等位基因特异性引物延伸(aspe)的原理。具体实施方式本发明的发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够同时检测多种心血管类药物相关基因多态性的引物组、试剂盒及试剂盒使用方法。术语液相芯片本文所用的术语“液相芯片”，是一种全新概念的生物芯片。该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球(5.6vm)用荧光染色的方法进行编码，然后将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用luminextm分析软件进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。实验原理参见图1。等位基因特异性引物延伸(aspe)本文所用的术语“等位基因特异性引物延伸(allelespecificprimerextension，aspe)”是一种基于溶液的序列特异性酶促反应技术，可用于在单个管中测定多个snp。aspe方法涉及两个阶段，首先是酶促反应，其确定靶基因型，然后在固体微球表面上捕获以进行检测。利用溶液相动力学阶段，这项技术容许用序列标记的微球(即本发明的寻址探针序列偶合的微球)检测新的模板(即，本发明的aspe扩增产物)。这是在与等位基因特异性寡核苷酸连接的适当捕获序列的帮助下完成的。aspe反应的模板是扩增的pcr片段。在设计延伸引物时，snp应存在于等位基因特异性引物的3′端，以进行准确杂交，捕获序列(tag序列)应位于引物的5′端。在等位基因特异性引物延伸步骤中，聚合酶通过掺入生物素标记的dntp(biotin-dctp)来延伸引物。仅当等位基因特异性引物的3′端与同源等位基因序列结合时才发生延伸，因此，延伸产物包含tag序列+目的靶基因位点+包含生物素标记的扩增片段。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅仅用于说明本发明的目的而非本发明的限制。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规实验条件例如sambrook等人，分子克隆实验指南(第四版)中所述的条件或按照产品制造商所建议的条件进行。实施例本发明所用的试剂和仪器如下：dna提取试剂盒tianampgenomicdnakit购自北京天根生化科技有限公司；多重pcr试剂盒taqtmhotstartversion购自takara公司；platinumtmgenotypetspdna聚合酶、核酸外酶i-虾碱性磷酸酶(exosap-it)、biotin-dctp、dntp、链霉亲和素-藻红蛋白(sa-pe)等均购自赛默飞世尔科技公司；lifeeco基因扩增仪购自中国透景生命科技有限公司；biodrop蛋白核酸分析仪购自豪沃生物科技有限公司；magplex-tag微球和luminex200购自美国luminex公司。实施例1.用于液相芯片技术检测心血管类药物相关基因的引物组引物和探针的设计：根据ncbi上公开的snp的rs号在genbank中寻找15个突变点附近的碱基序列，用primer6.0引物设计软件设计用于扩增如下心血管常见药物相关靶基因位点的特异性引物：cyp2c9基因的c430t多态性rs1799853、cyp2c9基因的a1075c多态性rs1057910、vkorc1基因的g1639a多态性rs9923231、cyp4f2基因的c1347t多态性rs2108622、cyp2c19基因的g681a多态性rs4244285、cyp2c19基因的g636a多态性rs4986893、cyp2c19基因的c806t多态性rs12248560、pon1基因的q192r多态性rs662、cyp2d6基因的c2850t多态性rs16947、cyp2d6基因的c100t多态性rs1065852、adrb1基因的g1165c多态性rs1801253、aldh2基因的g504a多态性rs671、gp1ba基因的t5c多态性rs2243093、pear1基因的g＞a多态性rs2768759和agtr1基因的a1166c多态性rs5186的引物。根据以上基因的位点多态性的核苷酸序列设计针对15种靶基因的位点多态性的特异性引物用于扩增15种靶基因位点的dna片段，并针对15种靶基因位点的野生型和突变型分别设计aspe引物序列，共计30条。aspe引物由tag序列+特异性引物序列组成。在引物设计过程中，为避免联合检测目的基因之间发生交叉反应，首先要避免十五对特异性引物之间发生非特异性扩增，使pcr正向引物和反向引物的tm差值小于5℃，同时将前5个pcr循环退火温度提高2℃，设为57℃；其次要避免aspe引物之间发生交叉延伸，进行特异性实验时如果aspe引物之间发生交叉反应，则重新设计aspe引物用primerplex软件设计高度特异性的aspe引物，突变点位于设计引物的3′端，通过aspe反应让pcr扩增产物偶联aspe捕获序列引物并延伸；此外，根据所设计的aspe特异性引物片段来设计tag序列，以最大限度地减少tag序列与aspe特异性引物片段之间可能形成的二级结构。由于多重pcr体系中多个引物和模板存在于同一个反应管里，实验过程中容易造成互相干扰，并且引物之间容易形成二聚体，从而影响aspe引物的延伸，甚至导致试验失败。因此引物设计是本发明的关键，也是进行luminex液相芯片检测的基础。本发明的发明人克服了上述多重pcr引物设计的难点，引物设计前需经过blast搜索以排除同源区间，并保证引物间pcr扩增产物在100-700bp；将上述八对引物集中为1个多重pcr体系进行pcr扩增；如果部分位点扩增效率不够，则调整其pcr引物浓度或者设计，或者调整多重pcr的引物组合，直到优化到可以比较均衡扩增出所有位点，完成pcr优化。经过大量的实验对设计的特异性扩增引物和aspe延伸引物进行筛选和改进，最后优选出用于扩增15个靶基因模板的15对特异性扩增引物(见表1)和用于延伸靶基因位点的30条aspe延伸引物(见表2)。表1.扩增出包含靶基因位点的目标序列的特异性扩增引物所述扩增出包含靶基因位点的目标序列的特异性扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条引物分别用去离子水配置成10μm的贮存液。表2.15对靶基因aspe延伸引物序列注：增粗字体为检测位点。所述aspe延伸引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条引物分别用去离子水配置成500nmol/l的贮存液。实施例2.本发明的利用液相芯片技术同时检测多个心血管类药物相关靶基因多态性的试剂盒本发明的试剂盒包括：1.实施例1中所设计的表1和表2中的引物。2.30种偶联有寻址探针序列的magplex-tag微球，所述寻址探针序列能够与aspe延伸引物中的tag序列互补配对。30种微球编号与微球上偶合的anti-tag序列如表3所示：表3.30种偶合有寻址探针序列(anti-tag序列)的magplex-tag微球选择的30种magplex-tag微球购自美国luminex公司，浓度为2.5×106个/ml，使用时稀释至每种微球含2500个，其中寻址探针序列偶合于微球上，与aspe引物中的tag序列互补配对。3.链霉亲和素-藻红蛋白杂交缓冲液、pcr反应液、dna聚合酶、阴性对照；其中链霉亲和素-藻红蛋白杂交缓冲液购自赛默飞世尔科技公司，浓度为6.5μg/ml，多重pcr反应液为10xbuffer，与dna聚合酶来自taqtmhotstartversion试剂盒，购自takara公司，阴性对照为等量的微球+去离子水。实施例3.用本发明的引物组和试剂盒检测常见心血管类药物相关靶基因多态性本实施例应用实施例1的引物组和实施例2的试剂盒检测了常见心血管类药物15种靶基因多态性。具体实验步骤如下：1.多重pcr扩增反应：共提取14份全血标本(血样来源于东莞厚街医院)，根据实验要求，另设一份阴性对照，提取dna。利用实施例1表1中的特异性扩增引物配制多重pcr反应体系(50μl)：成分用量(μl)gdna50ng(2μl)10×pcr反应缓冲液5taqtmhotstar0.25dntp(各2.5mm)4上下游引物(10μm)各0.5去离子水30.75pcr扩增参数设计如下：预变性：94℃30s循环：94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，共5次94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，共30次终延伸：72℃10min为验证用设计的引物进行pcr反应所得的pcr产物是否为包含靶基因位点的目标序列，留取部分pcr产物送广州艾基生物有限公司进行测序，测序结果与目标pcr产物吻合度良好。2.pcr产物的纯化：pcr反应结束后，产物会残留有多余的dntp、引物及单链产物，严重影响后续aspe的延伸反应，使用exosap-it可以将这些杂质清除。2.5μlexosap-it+5μlpcr产物37℃温育30min，以降解过量的引物、单链dna、dntp，随后80℃温育20min使酶失活，纯化pcr产物。3.aspe反应：纯化后的pcr产物在aspe反应体系中taqtmhotstar聚合酶的作用下，当引物3′末端第一个碱基与扩增的靶序列检测位点互补时，才能继续进行延伸反应，如果不互补，延伸反应将终止。aspe反应按如下优化反应体系进行：表4.aspe优化反应体系aspe反应参数设计如下：预变性：94℃90s；循环：94℃30s，57℃30s，74℃1min，40次；经过优化后的检测体系显示，本发明设计的引物特异性强，无交叉反应发生。本发明的aspe反应体系中生物素标记的dctp(biotin-dctp)浓度与不加标记的dctp浓度比值维持在3∶1是检测体系成功的重要因素之一，比值过高则影响aspe引物有效延伸，比值过低则荧光信号弱。4.杂交反应：选择的30种magplex-tag微球购自美国luminex公司，浓度为2.5×106个/ml，稀释至100个每微升，取25μl稀释的微球(含每种微球2500个)至96孔杂交板，对照孔加入等量的微球和去离子水，加入aspe反应产物2.5μl，吸打均匀。整个操作过程注意避光。杂交条件：96℃变性90s，37℃孵育30min。5.结果检测：将杂交后的微球重新悬浮于100μl含有6.5μg/ml链霉亲和素-藻红蛋白的1×杂交缓冲液中，37℃孵育20min后在luminex200仪器上进行检测。三、检测结果及数据分析经过luminex分析仪器检测，检测结果如表5所示。该仪器对荧光值(mfi)的要求为：检测位点mfi比率＝检测位点mfi/(突变mfi+野生mfi)，mfi比率＞0.75或者<0.25为纯合子，0.25-0.75之间为杂合子。用本发明的试剂盒所得检测结果的分辨率更高，纯合子的mfi比率基本大于0.9或者小于0.1，杂合子在0.35-0.65之间，说明检测结果的分辨率明显优于luminex公司提供的基因分型标准，本发明建立的检测试剂盒和引物能够以更高分辨率清晰辨别30种基因型，为临床合理用药提供实验室依据，具有极大的临床应用价值。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测14份全血样本的心血管类药物相关靶基因位点30种基因型的检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的液相芯片检测引物组及试剂盒能够准确地检测出心血管类药物相关靶基因多态性位点类型，且结果稳定可靠。实施例4.本发明的引物及试剂盒的检测特异性分析及临床标本验证实验为确保设计的本发明的特异性aspe引物能且只能在相应的检测位点进行延伸反应，本实施例针对单位点突变进行特异性检测，结果显示aspe引物探针与其他突变位点均无交叉反应，luminex200检测13份样本的15个靶基因结果见表6，各等位基因携带频率与hatmap基本一致。全部检测样本送广州艾基生物有限公司进行测序，luminex检测结果与测序结果完全一致，表明本发明的引物及试剂盒的aspe引物特异性高。实施例5.本发明的引物组及试剂盒的检测灵敏度性分析实验按照实施例3的最佳反应体系对稀释样本进行检测，dna浓度介于100-0.75ng之间。随着dna浓度降低，检测的mfi值逐渐下降，检测不同dna浓度之间的所有等位基因mfi比率差值小于0.03，检测结果见表7。三次检测均能清晰分辨靶位点基因型的最低浓度为1.5ng，说明本发明的引物组和试剂盒的检测灵敏度高。目前为止，暂时没有发现能同时检测心血管类药物常见15种靶基因位点的技术平台，本发明的引物组和试剂盒检测通量高，性价比高，具有极大的临床应用价值，能够同时检测华法林、氯吡格雷、硝酸甘油、阿司匹林、β受体阻断药等药物基因多态性，为临床提供及时、准确的用药信息，并且具有低成本、高特异性、高灵敏度、操作简单、组合灵活等优点。序列表<110>东莞市厚街医院<120>用液相芯片技术检测心血管疾病药物基因多态性的特异性引物及试剂盒<130>l019paf20180307<160>90<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tcagcaatggaaagaaatgg20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gaagatagtagtccagtaaggt22<210>3<211>43<212>dna<213>人工序列<400>3ttcttcattaacttctaatcttacaagaggagcattgaggacc43<210>4<211>43<212>dna<213>人工序列<400>4tacaacatctcattaacatatacaaagaggagcattgaggact43<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5aagtccaggaagagattgaa20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6cggtgatggtagaggttta19<210>7<211>42<212>dna<213>人工序列<400>7tacttctttactacaatttacaacggtggggagaaggtcaat42<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<400>8ctttctcatactttcaactaatttggtggggagaaggt38<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<400>9tgtcaccaagacgctaga18<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10ccatctgcaaccttaattcc20<210>11<211>44<212>dna<213>人工序列<400>11ttaaacaatctactattcaatcactgaaaaacaaccattggccg44<210>12<211>44<212>dna<213>人工序列<400>12taacttacacttaactatcatctttgaaaaacaaccattggcca44<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列<400>13ggaggtgatgttggatact19<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列<400>14agaagctggagaattgtgt19<210>15<211>42<212>dna<213>人工序列<400>15aatctctacaatttctctctaatactcagggtccggccacac42<210>16<211>42<212>dna<213>人工序列<400>16caataaacattctttacattctcactcagggtccggccacat42<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17aagcaggtataagtctagga20<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列<400>18ggttgttgatgtccatcg18<210>19<211>45<212>dna<213>人工序列<400>19ctttcttaatacattacaacatacagtaatttgttatgggttccc45<210>20<211>45<212>dna<213>人工序列<400>20tcaaactctcaattcttacttaatagtaatttgttatgggttcct45<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<400>21gtgatcccactttcatcct19<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<400>22tgggatattcatttcctgtg20<210>23<211>42<212>dna<213>人工序列<400>23acaaatatctaactactatcacaaattgtaagcaccccctgg42<210>24<211>42<212>dna<213>人工序列<400>24ctttatcaaattctaattctcaacattgtaagcaccccctga42<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列<400>25tgaacaggatgaatgtggta20<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<400>26cagcagcctaaacatgaaat20<210>27<211>44<212>dna<213>人工序列<400>27acactcatttaacactatttcattgtgtcttctgttctcaaagc44<210>28<211>44<212>dna<213>人工序列<400>28acacttatctttcaattcaattacgtgtcttctgttctcaaagt44<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列<400>29gaatagacagtgaggaatgc20<210>30<211>19<212>dna<213>人工序列<400>30aaccagtatgccttcacaa19<210>31<211>46<212>dna<213>人工序列<400>31tacattcaacactcttaaatcaaaattttcttgacccctacttaca46<210>32<211>46<212>dna<213>人工序列<400>32atactttacaaacaaataacacacattttcttgacccctacttacg46<210>33<211>18<212>dna<213>人工序列<400>33aatcacggcagtggtgta18<210>34<211>19<212>dna<213>人工序列<400>34gtgcagaattggaggtcat19<210>35<211>45<212>dna<213>人工序列<400>35tactacttctataactcacttaaagcttcaatgatgagaacctgg45<210>36<211>45<212>dna<213>人工序列<400>36actacttattctcaaactctaatagcttcaatgatgagaacctga45<210>37<211>19<212>dna<213>人工序列<400>37ttggtagtgaggcaggtat19<210>38<211>21<212>dna<213>人工序列<400>38actcaggactaactcatcttc21<210>39<211>41<212>dna<213>人工序列<400>39tacttaaacatacaaacttactcactgggctgcacgctacc41<210>40<211>41<212>dna<213>人工序列<400>40tcttactaatttcaatactcttacctgggctgcacgctact41<210>41<211>18<212>dna<213>人工序列<400>41catcatctactgccgcag18<210>42<211>18<212>dna<213>人工序列<400>42cctacaccttggattccg18<210>43<211>43<212>dna<213>人工序列<400>43tctctttaaacacattcaacaatattccgcaaggccttccagg43<210>44<211>43<212>dna<213>人工序列<400>44cttaacatttaacttctataacacttccgcaaggccttccagc43<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列<400>45gcaacgagccaagatcat18<210>46<211>19<212>dna<213>人工序列<400>46ataacgaagcccagcaaat19<210>47<211>42<212>dna<213>人工序列<400>47catcttcatatcaattctcttattggctgcaggcatacactg42<210>48<211>42<212>dna<213>人工序列<400>48caaatacataatcttacattcactggctgcaggcatacacta42<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列<400>49gtcactggaatccctatcag20<210>50<211>18<212>dna<213>人工序列<400>50tggagacctcacagatgg18<210>51<211>43<212>dna<213>人工序列<400>51cttaaactctacttacttctaattaggagg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