【技术领域】
本发明属于天然香料研究开发领域，特别涉及一种印度毛霉菌还原肉桂醛制备天然3-苯丙醇的方法。
背景技术：
肉桂醛是典型的α,β-不饱和醛，其加氢反应主要有两条路线：路线1是先加氢生成肉桂醇，再进一步加氢生成3-苯丙醇；路线2是先加氢生成3-苯丙醛，再进一步加氢生成3-苯丙醇。在化学催化肉桂醛的加氢反应中，由于c＝o键与c＝c键氢化的竞争反应，导致两条路线同时进行，得到的产物往往是肉桂醇、3-苯丙醛和3-苯丙醇的混合物(见“appliedcatalysisa:general”2000,(192):247-251,zhangy,etal.)。而微生物催化肉桂醛加氢反应的还原产物通常是肉桂醇(见“化工进展”2009,28(8):1431-1434,马丽等)。若要进一步加氢生成3-苯丙醇，则需再次加入微生物发酵液或湿菌体进行二次反应(见“广西大学”2013:62,张笮晦)。3-苯丙醇又名氢化肉桂醇、利胆醇，是制备香料、药物的重要中间体，可用于合成如选择性5-羟色胺重摄取抑制剂盐酸达泊西汀(见“中国药物化学杂志”2011,21(1):37-39,尹玲丽等)。天然3-苯丙醇产量低，仅存在于草莓、安息香膏、茶叶、桂油等中，在国际市场上供不应求。3-苯丙醇在工业上通常由肉桂酸乙酯催化加氢制得，收率可达85％，其缺点是需用大量乙醚对反应后的滤液进行提取，对环境不友好。
本发明人在科学实验中偶然发现，以从自然界获得的一种微生物的湿菌体为还原剂，能将肉桂醛连续还原生成3-苯丙醇。经鉴定：该微生物为印度毛霉菌mucorindicus，并命名为mucorindicusxj33。于是，我们将自己筛选纯化的印度毛霉菌mucorindicusxj33用于还原肉桂醛的研究，确定了其还原肉桂醛制备天然3-苯丙醇的生产工艺。为微生物法制备肉桂醛衍生物的“天然品”提供参考。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种印度毛霉菌还原肉桂醛制备3-苯丙醇的方法，以解决化学合成的3-苯丙醇用于食品、医药及化妆品时其安全性收到质疑等问题。本发明首次利用自行筛选的印度毛霉菌湿菌体作为生物还原剂连续还原肉桂醛制备天然3-苯丙醇，菌株培养简单，反应条件温和，环境友好，采用本发明方法制备得到的3-苯丙醇属于“天然品”范畴，其安全性优于化学合成的3-苯丙醇，具有良好的工业化应用前景。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种印度毛霉菌还原肉桂醛制备天然3-苯丙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1：将一环斜面培养基上的微生物菌株xj33接种于已灭菌的发酵培养液中。所述培养液包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸氢二钾、氯化钠、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁。在温度为30℃，转速为180r/min下培养72h，制得xj33发酵液；
s2：将步骤s1制得的xj33发酵液抽滤，得到xj33湿菌体；
s3：将步骤s2制得的xj33湿菌体分散于缓冲溶液中，加入辅助底物，再加入肉桂醛，在温度为30℃，转速为180r/min下转化72h，制得转化液；
s4：将步骤s3制得的转化液抽滤，加入等体积萃取剂进行萃取1～2次，经减压蒸馏回收萃取剂后，制得含3-苯丙醇的油状物。
进一步地，步骤s1中所述微生物菌株为印度毛霉菌。
进一步地，步骤s1中所述培养液包括以下成分：葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l。
进一步地，步骤s3中所述的xj33湿菌体质量浓度为20～100g/l。
进一步地，步骤s3中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的ph值为6～8。
进一步地，步骤s3中所述肉桂醛的质量浓度为2.096～4.192g/l。
进一步地，步骤s3中所述辅助底物为葡萄糖、乙醇、蔗糖中的一种。
进一步地，所述辅助底物的质量浓度为10～50g/l。
进一步地，步骤s4中所述萃取剂为乙酸乙酯。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次利用自行筛选的印度毛霉菌xj33湿菌体作为生物还原剂连续还原肉桂醛制备3-苯丙醇。菌株培养简单，反应条件温和，环境友好，采用本发明方法制备得到的3-苯丙醇属于“天然品”范畴，其安全性优于化学合成的3-苯丙醇，具有良好的工业化应用前景。
【具体实施方式】
为便于更好地理解本发明，通过以下实施例加以说明，这些实施例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。
在实施例中，所述印度毛霉菌还原肉桂醛制备天然3-苯丙醇的方法，包括以下步骤：
s1：将一环斜面培养基上的印度毛霉菌xj33接种于已灭菌的发酵培养液中，所述培养液包括以下成分：葡萄糖30g/l、蛋白胨30g/l、酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l，在温度为30℃，转速180r/min下培养72h，制得印度毛霉菌xj33发酵液；
s2：将步骤s1制得的发酵液抽滤，得到xj33湿菌体；
s3：将步骤s2制得的质量浓度为20～100g/l的xj33湿菌体分散于ph值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入质量浓度为10～50g/l的辅助底物，所述辅助底物为葡萄糖、乙醇、蔗糖中的一种，再加入质量浓度为2.096～4.192g/l的肉桂醛，在温度为30℃，转速为180r/min下转化72h，制得转化液；
s4：将步骤s3制得的转化液抽滤，加入等体积乙酸乙酯进行萃取1～2次，经减压蒸馏回收乙酸乙酯后，制得含3-苯丙醇的油状物。
下面通过更具体实施例对本发明进行说明。
本发明的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33是一种属于真菌类印度毛霉菌属的菌株，该菌株是从土壤中分离，并先后经过肉桂醛耐受性筛选和还原肉桂醛能力的筛选的多轮筛选获得的，根据16srdna分子生物学鉴定，该菌与印度毛霉菌菌(mucorindicus)的同源性为100％。
实施例1
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将40g/l湿菌体分散到100mlph6.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例2
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将40g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例3
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将20g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例4
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将80g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例5
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将80g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入30g/l蔗糖作为辅助底物，再加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例6
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将80g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入30g/l乙醇作为辅助底物，再加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例7
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将80g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入30g/l葡萄糖作为辅助底物，再加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例8
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将80g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入10g/l葡萄糖作为辅助底物，再加入2.62g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
实施例9
将一环斜面培养基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接种到已灭菌的100ml发酵培养液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氢二钾1g/l、氯化钠0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l)，30℃下恒温培养振荡器(180r/min)培养72h，得到xj33发酵液。将发酵液抽滤，得到xj33湿菌体。将80g/l湿菌体分散到100mlph8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入10g/l葡萄糖作为辅助底物，再加入4.192g/l肉桂醛，在30℃，180r·min-1，反应72h，得到转化液。
分别取实施例1-9的转化液抽滤，用等体积乙酸乙酯萃取1次，减压蒸馏至1～2ml后制得含3-苯丙醇的油状物，所述油状物用乙酸乙酯定容于10ml容量瓶。取0.6μl用gc进行定量分析，并用gc-ms进行定性分析，分析条件如下：
色谱条件：色谱柱：rxi-5sil(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；程序升温过程：柱初温100℃，保留1min，以5℃/min升至200℃，保留1min，再以8℃/min升至250℃；分流比1:30。
质谱条件：电子轰击(ei)离子源，电离能量70ev，电子倍增器电压1.5kv，全扫描方式。
定性及定性分析：根据总离子流图，应用nist08、nist08s质谱库检索，确认了还原产物为3-苯丙醇。采用外标法，配制一系列不同浓度的3-苯丙醇标准溶液进行gc色谱分析。以各浓度标准溶液的峰面积对其质量浓度(μg/ml)进行线性回归，得到回归方程，计算3-苯丙醇的得率，结果见表1。
表1实施例1-9中3-苯丙醇的得率及其性能
由表1可见，采用本发明的方法制备的3-苯丙醇得率较高，从实施例4与实施例5-8制备的3-苯丙醇得率可知，辅助底物(蔗糖、乙醇、葡萄糖)的加入能显著提高3-苯丙醇的得率。同时所得3-苯丙醇属于“天然品”范畴，其安全性优于化学合成的3-苯丙醇，具有良好的工业化应用前景。
以上内容不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。