高灵敏监测POPs的转荧光蛋白基因鱼的制作与应用的制作方法

文档序号：11230094阅读：843来源：国知局

本发明涉及基因工程与环境科学领域，特别是涉及一种高灵敏监测pops的转荧光蛋白基因鱼的制作与应用。

背景技术：

生物监测是指从生物学角度评价环境质量状况的过程，通过观测生物个体、种群或群落对环境质量及其变化所产生的反应和影响，进而阐明其所处环境污染的性质、程度和范围，包括生物种群及群落调查、急性慢性毒性试验、水体微生物测试和鱼类组织污染物分析。德国是最早开展生物监测的国家，早在20世纪初，已经开展利用水生生物监测水质的工作，时至今日，欧盟、美国等发达国家均已建立了相对比较完备的环境生物监测体系。中国起步相对较晚，1993年随着《水生生物监测手册》的出版，初次建立了国家水生生物监测网，开始在全国范围内开展水生生物监测工作。直至21世纪初，生物监测工作才再次得到重视。

目前传统的生物监测方法，耗时费力，且不能用于直观监测。2001年，mattingly等证实人的cyp1a1启动子在tcdd的诱导下在48hpf前胚胎中可以观察到gfp的局部表达，但不能用于活体直观监测。2004年，nebert等公布了利用luc转基因斑马鱼监测芳香烃类pops的专利(专利号：us20040147030)，但是该技术所使用的斑马鱼所转基因为luc，检测持续性有机物灵敏度低，同时也不能解决外源基因在受体鱼中的整合、表达和遗传问题；此外，检测luc基因表达需要特殊仪器。因而，他们所研制的转luc基因斑马鱼一直未能在环境有毒污染物的监测中得到实际应用。ngghb(2013)制作了转绿色荧光蛋白青鳉以及kun-heekima(2013)制作了转绿色荧光蛋白斑马鱼，这个绿色荧光蛋白前带有可以诱导的cyp1a启动子，在进行tcdd暴露后青鳉和斑马鱼荧光表达均有不同程度的增强，但是这些转基因鱼只在实验室内进行毒物的检测，并没有将其应用到环境监测中来，并且绿色荧光在显微镜观察下腹部具有明显的背景值，不便于观察。因此构建荧光蛋白斑马鱼并在环境中进行有效应用是当前急需解决的问题。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种监测pops的转荧光蛋白基因鱼的制作与应用，用于解决现有技术中监测环境中有毒物质时灵敏度低、不便于观察等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种监测pops的转荧光蛋白基因鱼的培养方法，包括如下步骤：

1)获取响应启动子：提供能被pops诱导表达的基因的启动子序列，设计引物，扩增得到对持续有机污染物有响应的启动子，即响应启动子；

2)载体构建：将步骤1)获得的响应启动子连接到载体中，得到连接有响应启动子的载体，即响应载体，所述响应载体还包括荧光蛋白序列；

3)注射培养：将核酸酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至鱼的受精卵，培养获得能够监测水体中pops的转荧光蛋白基因鱼。

进一步地，步骤1)中，被pops诱导表达的基因选自cyp1a基因。

进一步地，步骤1)中，所述响应启动子选自cyp1a启动子，所述cyp1a启动子含有如seqidno.1所示的序列。

进一步地，步骤3)中，所述鱼选自斑马鱼，当然，其他鱼类也可适用。根据鱼的种类扩增其cyp1a启动子序列。

进一步地，所述pops选自tcdd、pahs中的至少一种。pahs包括但不限于nap、phe、baa、bap、bghip。

进一步地，步骤1)中，提取并纯化鱼的基因组dna，通过巢式pcr获得响应启动子。

进一步地，步骤1)中，巢式pcr第一轮反应的引物为cyp1a-nested-f和cyp1a-nested-r，cyp1a-nested-f的序列如seqidno.2所示，cyp1a-nested-r的序列如seqidno.3所示。

进一步地，步骤1)中，巢式pcr第二轮反应的引物为cyp1a-apa1-f和cyp1a-apa1-r，cyp1a-apa1-f的序列如seqidno.4所示，cyp1a-apa1-r的序列如seqidno.5所示。

进一步地，步骤2)中，所述响应载体带有i-scei大范围核酸酶转移系统。

进一步地，步骤2)中，所述荧光蛋白选自mcherry。

进一步地，步骤1)中，将pcr产物与peasy-blunt3cloningvector连接，获得peasy-cyp1apromoter质粒。

进一步地，步骤2)中，采用转染试剂将响应载体瞬时转染至细胞中，污染物暴露，筛选得到对pops有响应效果的响应载体，转入下一步进行注射。

进一步地，步骤3)中，所述核酸酶选自i-scei酶。

进一步地，步骤3)中，将核酸酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至鱼的受精卵，培养获得f0代鱼，筛选获得对pops有响应的f0代鱼，将有响应的f0代鱼与野生型鱼杂交，收集鱼卵，污染物暴露，筛选得到对pops有响应的f1代鱼，f1代鱼再次与野生型鱼杂交，收集鱼卵，污染物暴露，筛选得到对pops有响应的f2代鱼，将f2代鱼自交，获得f3代鱼，从f3代鱼中筛选得到对pops有响应的纯系转荧光蛋白基因鱼。

本发明第二方面提供上述方法培养获得的转荧光蛋白基因鱼。

本发明第三方面提供上述转荧光蛋白基因鱼在监测水体pops中的应用。

本发明第四方面提供一种响应载体，所述响应载体带有i-scei大范围核酸酶转移系统，所述响应载体包括响应启动子序列以及荧光蛋白序列。

进一步地，所述响应启动子选自cyp1a启动子，所述cyp1a启动子含有如seqidno.1所示的序列。

进一步地，所述荧光蛋白选自mcherry。

本发明第五方面提供上述响应载体用于培养荧光蛋白基因鱼的用途。

如上所述，本发明的一种监测pops的转荧光蛋白基因鱼的制作与应用，具有以下有益效果：本发明针对目前传统水环境pops(持续性有机污染物)监测方法繁琐，且需昂贵的仪器及专业的技术人员，不能实现对环境pops进行有效的监测等缺陷，本发明利用pcr技术原理，从鱼的自身获得对pops敏感的cyp1a基因启动子，并构建携带i-scei大范围核酸酶转移系统和荧光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry质粒，最后通过显微注射技术，获得可以对水体中pops进行简单、高效、直观监测的转红色荧光斑马鱼。因此，与传统的pops监测手段相比，本发明提供了一种方便快捷的生物监测手段，对实现pops实时监测有重要的推动作用。

附图说明

图1显示为本发明实施例的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry质粒图谱。

图2显示为本发明实施例的细胞荧光验证图。

图3显示为本发明实施例中采用tcdd暴露转红色荧光斑马鱼之后的荧光验证图。

图4显示为本发明实施例中不同pahs暴露转红色荧光斑马鱼之后的荧光图。

图5显示为本发明实施例中各土样提取液暴露转红色荧光斑马鱼之后的荧光图。

图6显示本发明实施例中各土样提取液暴露转红色荧光斑马鱼之后的荧光强度定量图。

图7显示为本发明实施例中各土样的pahs含量图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

一、cyp1a启动子扩增

1、斑马鱼基因组dna提取：取野生型ab斑马鱼，剪取尾鳍20-30mg于蒸馏水中漂洗数次，吸水纸吸干表面水分，置于1.5ml离心管中，眼科剪剪碎，按takara组织提取试剂盒操作说明，加入组织裂解液200μl，蛋白酶k20μl，rna酶10μl，漩涡混匀，置于56℃水浴锅裂解2-3h，至无明显组织块。后续按试剂盒说明进行基因组dna的提取与纯化。采用的试剂盒为takaramninbestuniversalgenomicdnaextactcionkitver5.0，货号：9765，供应商：宝生物工程(大连)有限公司。cyp1a基因是根据文献查找，根据前人的实验结果得到，其具体公开于：zeruthg1,pollenzrs.isolationandcharacterizationofadioxin-induciblecyp1a1promoter/enhancerregionfromzebrafish(daniorerio)zebrafish2(3),197-210(2005)。

2、pcr扩增：根据在ncbi上查询所得cyp1a启动子序列，其序列如seqidno.1所示，用primer5引物设计软件进行引物设计。利用hsdnapolymerase进行巢式pcr，第一轮反应采用引物cyp1a-nested-f(其序列如seqidno.2所示)和cyp1a-nested-r(其序列如seqidno.3所示)，pcr反应体系为50μl，具体包括：5xprimestarbuffer(mg²⁺plus)10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、cyp1a-nested-f+rmix1μl、hsdnapolymerase0.5μl、zebrafishgenomedna1μl、ddh2o33.5μl；pcr反应程序为：98℃预热2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共30个循环，最后72℃延伸10min；以第一轮反应液为模板进行第二轮pcr反应，引物为cyp1a-apa1-f和cyp1a-age1-r，cyp1a-apa1-f序列如seqidno.4所示，cyp1a-age1-r序列如seqidno.5所示，反应体系同第一轮反应，反应退火温度提高到58℃，待反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，利用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(该试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)回收目的条带，回收方法按试剂盒操作说明进行操作。

3、目的片段连平端载体并测序：胶回收pcr产物与peasy-blunt3cloningkit(货号：cb301-01生产商：北京全式金生物技术有限公司)连接，克隆反应体系为5μl，具体包括：pcr产物50ng、peasy-blunt3cloningkit1μl，总体积不足5μl时，用水补足至5μl，25℃反应18min，反应结束后将连接产物加入50μltrans1-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入250μl平衡至室温的lb培养基，在200rpm(摇床转速)、37℃下培养1h。5000rpm离心1min，弃掉部分上清，剩余部分混匀，取全部菌液涂la平板，37℃过夜培养。次日菌落pcr挑取阳性克隆，摇菌过夜，提质粒送江苏金维智生物科技有限公司测序，测序结果与ncbi序列进行比对，与预期结果一致，该载体命名为peasy-cyp1apromoter。

二、质粒构建

1、质粒酶切回收目的条带：将质粒peasy-cyp1apromoter和质粒pi-scei-cmv-mcherry质粒(实验室已有质粒，其序列如seqidno.12所示)用赛默飞快切酶apai和agei进行双酶切，37℃恒温水浴锅放置30min，琼脂糖凝胶电泳回收cyp1apromoter片段和pi-scei–mcherry骨架。cyp1apromoter即cyp1a启动子，其序列如seqidno.1所示，pi-scei–mcherry骨架序列如seqidno.10所示。快切酶apai和agei均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。mcherry序列如seqidno.8所示。

2、采用t4dna连接酶(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)进行连接反应：20μl反应体系包括10×buffer2μl、cyp1apromoter片段50ng、pi-scei–mcherry骨架100ng、t4dna连接酶0.2μl、余量为水。pcr仪中22℃连接1h，取10μl加入100μl感受态中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上2min，加入850μl平衡至室温(25℃)的lb培养基，180rpm、37℃培养1h。5000rpm离心1min，弃掉部分上清，剩余混匀，取全部菌液涂la平板，37℃过夜培养。次日菌落pcr挑取阳性克隆，摇菌过夜，提质粒酶切鉴定，阳性质粒送江苏金维智生物科技有限公司测序，测序结果与预期一致，该载体命名为pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，图1所示为pi-scei-cyp1apromoter-mcherry质粒图谱。pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列如seqidno.9所示。

三、质粒荧光诱导效果验证

1、细胞传代铺板：利用人肝癌细胞hepg2进行荧光诱导效果验证试验，将25ml细胞培养瓶中细胞消化传代至96孔细胞培养板中，接种细胞数量为1×10⁴个/孔，培养基为有血清无抗生素高糖dmem培养基。胎牛血清(fbs)含量为10％；dmem，highglucose(货号：11965175)；胎牛血清(fbs)货号：10100147。dmem与胎牛血清均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

2、细胞转染：第二天，待上述96孔板中细胞长至70～80％融合，将步骤二中构建好的质粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry利用viafect^tm转染试剂(名称：viafect^tmtransfectionreagent；货号：e4981；供应商：普洛麦格(北京)生物技术有限公司)进行细胞转染，转染液体系为：10μldmem、0.1μg质粒、0.3μl转染试剂，配制混合物时，先加质粒至dmem培养基中混合均匀，然后将转染试剂直接加入到培养基中，不要沾到离心管壁上，立即吹打混匀，室温孵育10min。然后将混合物滴加至培养的细胞中，轻轻吹打混合均匀，继续培养6-8h。

3、tcdd梯度暴露：tcdd设置的浓度梯度为0、0.01、0.05、0.1和0.5nm，按照浓度要求加入完全培养基中，细胞继续培养24h，利用荧光倒置显微镜观察荧光表达情况，如图2所示为细胞荧光图，其中，c图是指没有转染质粒的细胞荧光图。

四、显微注射

显微注射采用eppendorffemtojet4i显微注射仪。显微注射前夜，挑取性成熟ab型斑马鱼雌雄鱼进行配对，雌雄数量比例为1:1(雌雄斑马鱼各两条)，雌雄鱼用隔板分开，待第二天开灯后根据注射需要依次打开隔板，打开隔板后，雄鱼追尾雌鱼，数分钟后雌性斑马鱼即可排卵，收集受精卵用清水简单清洗，用吸管依次排放在注射凹槽中。取步骤三验证的重组质粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，将该重组质粒和i-scei酶共注射到斑马鱼一细胞期胚胎中，注射液体系为10μl：pi-scei-cyp1apromoter-mcherry质粒终浓度20～50ng/μl、10×buffer1μl、i-scei酶0.5μl、酚红0.5μl，加双蒸水补足至10μl。注射时，根据毛细玻璃管针尖大小，调试合适的注射压力和注射时间，注射针从植物极穿过到达动物极，轻踏注射踏板可以看到红色注射液进入胚胎动物极，轻轻抽出即可完成注射，单个胚胎质粒注射量控制在20-50pg。斑马鱼1细胞期的时间约为0.5h，超过1细胞期的胚胎不进行注射。注射完成后吸取孵化水将胚胎从注射盘上冲洗到一个干净的培养皿中，28℃恒温培养，获得转基因斑马鱼f0代。

五、纯合子筛选

1、斑马鱼基因组dna提取：将步骤四显微注射所得斑马鱼胚胎精心饲养至两月龄。剪取尾部，双蒸水漂洗数次，吸水纸吸干表面水分，镊子夹取放入1.5ml离心管中，用眼科剪尽量剪碎，加入100μlctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)裂解液(100mmtris-hclph8.5,0.5medta,10％sds,5mnacl)，同时加入1μl20mg/ml的蛋白酶k漩涡振荡混匀，55℃水浴裂解2-3h，中间漩涡振荡混匀数次，直至组织块完全裂解。加入150μl氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心4min，小心吸取上清(约80μl)至新的0.6ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀可见絮状沉淀，12000rpm离心4min，弃上清，加入300μl75％乙醇，颠倒悬浮洗涤沉淀，10000rpm离心4min，弃上清，倒置晾干，加入20μl双蒸水溶解沉淀，微量分光光度计进行浓度和纯度检测。

2、pcr检测目的基因：根据注射外源质粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列设计检测引物，pcr反应采用fasttaqdna聚合酶(购自北京全式金生物技术有限公司)，反应体系为20μl，具体包括：10xbuffer2μl、dntpmix1.6μl、fasttaqdnapolymerase0.1μl、10μm引物cyp1a-jc-f和cyp1a-jc-r的混合液0.4μl、斑马鱼基因组dna模板1μl、双蒸水14.9μl。反应程序为：94℃3min，94℃5s，55℃15s，72℃10s；共35个循环，72℃延伸5min，16℃保存。反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳检测。引物cyp1a-jc-f序列如seqidno.6所示，引物cyp1a-jc-r序列如seqidno.7所示。

3、连接pmd-19t送测序验证：取上述步骤2中有目的条带的阳性pcr产物2μl，加入2μl双蒸水和1μlpmd-19t载体(名称：pmd-19tvectorcloningkit；货号：6013；供应商：宝生物工程(大连)有限公司)，加入5μlsolutioni混匀，16℃反应30min。反应结束后，取反应液加入100μl感受态中，用枪头轻轻搅拌混匀，冰浴30min，42℃热激1.5min，加入850μllb培养基，180rpm、37℃恒温摇床活化1h，5000rpm离心1min，弃部分上清，余下部分混匀涂布在具有羧苄青霉素的lb平板(羧苄青霉素在lb培养基中的浓度为100μg/ml)上，37℃倒置过夜培养。次日，菌落pcr验证，阳性菌落摇菌过夜扩大培养，提质粒送江苏金维智公司测序，测序结果如seqidno.11所示，与预期一致。

4、f0代阳性转基因鱼后代验证：取前述步骤四获得的转基因斑马鱼f0代，将f0代转基因斑马鱼与野生斑马鱼进行一对一配对，收集f1代受精卵，次日随机挑取5颗，按照步骤1-2的方法提取基因组dna，并进行pcr验证。对pcr扩增获得阳性条带的受精卵，加入终浓度为1nm的tcdd进行暴露，暴露2天，荧光显微镜观察荧光。将具有荧光的仔鱼挑出进行饲养，直至性成熟。

5、转红色荧光斑马鱼纯合子筛选：筛选出有红色荧光表达的f1代，继续培养至性成熟，再次与野生型斑马鱼杂交，低浓度tcdd暴露获得有荧光表达的斑马鱼f2代，最后将筛选的f2代斑马鱼培育至性成熟后自交获得f3代，f3代与野生型杂交，若后代均有荧光表达，则表示该f3代个体为纯合子。

六：化学标准品和环境样品检测

1、转荧光斑马鱼胚胎收集：试验前夜，将转基因红色荧光蛋白斑马鱼品性成熟雌雄斑马鱼配对，次日收集胚胎于28℃恒温培养箱12h，剔除其中未受精的斑马鱼胚胎。

2、化学标准品暴露：tcdd暴露共设置0.05、0.1、0.5、1和5nm五个浓度梯度，五种多环芳烃(pahs)暴露浓度为0μm萘、10μm菲、10μm苯并蒽、1μm苯并芘、10μm苯并苝，用dmso作为对照组，每个浓度梯度设置3个平行样，每个平行样放置50颗胚胎。胚胎置于生化恒温培养箱培养60h，期间注意观察，及时清除死卵，避免恶化水质。暴露结束，ms-222麻醉，利用nikon体式荧光显微镜进行荧光观察记录。

3、环境样品暴露：

3.1、样品来源：巴基斯坦卡拉奇电子垃圾回收站点土样，采自卡拉奇三个地区共14个采样点：lyari(ly124°85'71"n66°99'44"e、ly224°86'51"n67°01'96"e、ly324°88'09"n67°02'26"e、ly424°86'62"n67°08'52"e)、surjanitown(sj125°06'01"n67°06'01"e、sj225°02'77"n67°07'40"e、sj325°05'28"n67°11'83"e、sj425°02'23"n67°11'77"e、sj524°97'53"n66°09'64"e)和jacoblines(jc124°86'81"n67°02'40"e、jc224°85'26"n67°04'39"e、jc324°87'50"n67°04'42"e、jc424°86'99"n67°09'76"e、jc524°89'46"n67°07'64"e)。其中16种pahs含量由该地球化学所分析提供。

3.2、样品处理：采用quechers方法对土样中的pahs进行提取。在50ml玻璃离心管中加入4g电子垃圾样品、4gmgso4和1gnacl，然后加入10ml提取溶剂(按体积计，二氯甲烷：己烷＝1:1)。漩涡振荡混匀，室温放置过夜。次日，漩涡振荡15min，超声2min，重复两次。2500rpm离心5min，吸取上清液至30ml玻璃离心管中，加入150mg硫酸镁和25mgpsa。漩涡振荡2min，2500rpm离心5min。吸取上清液5ml到8ml棕色样品瓶中，氮吹仪吹干，加入1mldmso漩涡振荡重新溶解，振荡时注意转速，避免将液体振荡到盖子上。

3.3、样品提取液暴露转基因荧光斑马鱼胚胎：按步骤1中方法收集转基因荧光斑马鱼胚胎，采用90mm玻璃培养皿进行暴露，每个培养皿中加入50颗胚胎、30ml去离子水，并加入30μl上述步骤3.2中电子垃圾样品提取液，对照组加30μldmso，倒八字混匀，置于28℃生化恒温培养箱中暴露60h，每个样品三个平行。暴露结束用nikon荧光体式显微镜对暴露幼鱼进行荧光观察，并进行荧光强度测定。

4、转基因荧光斑马鱼检测结果分析

4.1、化学标准品检测验证

利用不同梯度tcdd暴露转基因荧光斑马鱼结果如图3所示，斑马鱼荧光强度随暴露浓度的增加而增加，具有明显的浓度依赖效应。图4中pahs暴露结果显示，萘和菲无明显的诱导效果，苯并苝有诱导效果但不是很明显；苯并芘诱导效果最为明显，可见腹部荧光明显增强，苯并蒽荧光诱导效果次之。

4.2、电子垃圾掩埋点附近土样浸提液暴露结果

图5显示为各土样提取液的暴露结果图，nc是指没有暴露的对照组结果图；图6显示为各土样提取液暴露的斑马鱼荧光强度图，c是指没有暴露的斑马鱼荧光强度图。

如图7所示为各土样的pahs含量图，三个地区中，采自lyari的土样pahs含量最高，其荧光诱导效果也最明显。荧光强度和样品中pahs含量总体趋势一致。但样品中成分相对比较复杂，不能达到一一对应的效果。

三个地区土样中pahs含量数据如下表1所示：

表1

综上所述，本发明针对目前传统水环境持久性有机污染物(pops)检测方法繁琐，且需昂贵的仪器及专业的技术人员，不能实现对环境pops进行有效的检测等缺陷，本发明利用pcr技术原理，从鱼的自身获得对pops敏感的cyp1a基因启动子，并构建携带iscei大范围核酸酶转移系统和荧光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry质粒，最后通过显微注射技术，获得可以对水体中pops进行简单、高效、直观监测的转荧光斑马鱼。因此，与传统的pops检测手段相比，本发明提供了一种方便快捷的生物检测手段，对实现pops实时监测有重要的推动作用。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

sequencelisting

<110>中国科学院重庆绿色智能技术研究院

<120>高灵敏监测pops的转荧光蛋白基因鱼的制作与应用

<130>pcqls171969

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2685

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a启动子序列

<400>1

agccgaacaggagggtaaatagagcagaactagtgaacctcttctcctcctccagctcac60

gcaacgtggccaatctttaacccgcgctacaggtgcgcgcacgcgatgctgtttgatcag120

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gagttacgagcgcgtgccagatcagcagagactcaaacatgcaggcaattatcggatgtg480

ttgcaacaaacaatttatttagttcacataattgcctaaaccatcacactgatttatgac540

actttagcttagacagctttaaaagataaataaacatctcgagcatgctgtttaactttt600

catgatttatatattctgattttattgggcttatttatttctcgcataataattatgcgc660

attgagtttgctgtatagtgctctctgtgtgtgtttttaagagttgtgatgaaatgtgag720

attgatttctcagttaatgcacgtcgcttttgtctacaaactgttctgtaaaatattaac780

attattacataacatcaaaaacaccgataagcccagttctgcctaattataaaggctaat840

taagcgtctcatttattaatttatttcatttatttatgttttaaatatatatttgtttac900

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ttgacatatatgattacgttacataaatattgacatatatataattacgttacataaata1140

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ataaatattgacatatatgattacattacataaatattgacatatataattacgttacat1320

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