大豆蛋白及其编码基因的应用及引物、表达载体和制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种大豆蛋白及其编码基因的应用及引物、表达载体和制备方法。

背景技术：

盐碱、干旱等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。这些环境因子导致植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。因此，如何提高植物的抗逆功能，一直是人们研究的课题。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大豆蛋白及其编码基因的应用及引物、表达载体和制备方法，该大豆蛋白的基因编码为glyma06g25310.1，本发明中旨在提供一种该大豆蛋白在提高植物耐盐性中应用。

本发明的技术方案如下：

一种大豆蛋白的应用，其中，所述大豆蛋白的基因编码为glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白用于提高植物或大肠杆菌的耐盐性。

一种大豆蛋白的编码基因的应用，其中，所述大豆蛋白的基因编码为glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白的编码基因用于提高植物或大肠杆菌的耐盐性。

一种用于制备大豆蛋白或其编码基因的引物，其中，所述大豆蛋白的基因编码为glyma06g25310.1，引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

一种用于提高耐盐性的表达载体，其中，所述表达载体为携带有seqidno.4所示的大豆蛋白基因，用于表达基因编码为glyma06g25310.1的大豆蛋白。

所述的用于提高耐盐性的表达载体，其中，所述表达载体用pet-28a蛋白表达载体重组得到，该大豆蛋白基因通过酶切位点ndei和xhoi连接在表达载体上。

一种用于提高耐盐性的表达载体的制备方法，其中，其制备方法包括以下步骤：

扩增目的基因：以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作为引物，以大豆r0期胚根cdna为模板，进行pcr扩增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如seqidno.4所示；

构建重组质粒：将目的基因片段与经ndei和xhoi双酶切的蛋白表达载体pet-28a，通过t4连接酶连接酶切产物，构建pet-28a重组质粒。

所述的用于提高耐盐性的表达载体的制备方法，其中，构建重组质粒过程中，包括以下步骤：

将目的基因片段和经过双酶切的pet-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5μlt4连接酶，1μl10×buffer，用水补齐至10μl，16℃连接过夜。

有益效果：本发明中首次发现该蛋白可以提高大肠杆菌的耐盐性，对于其在植物抗逆工程上的应用具有指导意义。该大豆蛋白可增强大肠杆菌的耐盐性，由于很多抗逆基因在大肠杆菌和植物体系具有相似的抗逆功能，因此，该基因在植物抗逆领域具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用pcr扩增大豆基因片段的电泳结果图(m为dl2000marker)。

图2为本发明实施例1中利用菌落pcr验证重组菌的电泳结果图(m为dl2000marker)。

图3为本发明实施例5中17号蛋白的诱导表达的电泳结果图。

图4为本发明实施例6中空载体转化菌在不同浓度的高盐lb固体培养基和正常固体培养基的生长结果图。

图5本发明实施例6中重组质粒转化菌在不同浓度的高盐lb固体培养基和正常固体培养基的生长结果图。

图6本发明实施例6中空载体转化菌和重组质粒转化菌的存活率柱形图。

具体实施方式

本发明提供一种大豆蛋白及其编码基因的应用及引物、表达载体和制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的一种大豆蛋白及其编码基因的应用，是将所述大豆蛋白或其编码基因用于提高植物或大肠杆菌的耐盐性。其中，所述大豆蛋白的基因编码为glyma06g25310.1。该大豆蛋白可增强大肠杆菌的耐盐性，由于很多抗逆基因在大肠杆菌和植物体系具有相似的抗逆功能，因此，该大豆蛋白及其编码基因在植物抗逆领域具有潜在的应用前景。

所述大豆蛋白的基因序列(seqidno.1)如下所示：

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtcctaactctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaacaccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacacataacaaaaaaaaaaagtgaaaaatggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctgaactggtgaggtcaaaagcctggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttagatctgtttgaaatgactgtagtttttgttaatgttatttctctgattgtttattgaaataacaatatacaattatagagcatagccgtatcatgtaccacccttgggtgtattggacagacgtgtagcttctagttgcttttgtaacattatgttgtaagatgtgatatggacctgtaatcatatatgtaaggaagtgatcctatata。

本发明中，以r0期和r15期大豆胚根作为实验材料，采用100℃热处理10min后离心获得上清，富集得到的可溶性蛋白即为热稳定蛋白。根据蛋白组学和结构预测结果，在r0期高表达蛋白中挑选了1个蛋白进行结构和功能分析，该蛋白即本发明所述大豆蛋白。本发明中还提供用于扩增该大豆蛋白基因序列的引物，根据pmd19-t载体和基因的序列特点引入相应酶切位点的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分别引入核酸内切酶(ndei)和(xhoi)两端的同源序列。引物的序列如下所示：

f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’(seqidno.2)；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’(seqidno.3)。

本发明中还提供一种用于提高耐盐性的表达载体，所述表达载体用pet-28a蛋白表达载体重组得到，该大豆蛋白基因通过酶切位点ndei和xhoi连接在表达载体上。

本发明中还提供一种用于提高耐盐性的表达载体的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

扩增目的基因：根据pmd19-t载体和基因的序列特点引入相应酶切位点的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分别引入核酸内切酶(ndei)和(xhoi)，以f：3’-atggcgagcgcagtggagaag-5’；r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc-5’作为引物，以大豆r0期胚根cdna为模板，进行pcr扩增，得到目的基因片段；目的基因片段的基因序列(seqidno.4)如下所示：

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctga。

构件重组质粒：将目的基因片段与经ndei和xhoi双酶切的蛋白表达载体pet-28a，通过t4连接酶连接酶切产物，构建pet-28a重组质粒。pet-28a重组质粒的基因序列(seqidno.5)如下所示：

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgaggcttcggccttgtttatctcatcaagcttgtgatgttcttcaccgttcacttttgttccttctatttccccaacttcaaattcatgagtacttttgacgtgatcctctttattcactccttccacttcaaccgttttgtctgcagtagtgcatgtttccaatttctctggctccccaaatccactatattcttttgtctcttcctgtggttgctcaatcttttcttcatcctttctcagaaaaacttcagagccctcagttactttgtcatcagctttatcttttaatgcaggtagttctccatcagcagcattggatttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacgagtggatttgttgacatctgtatcttccacactcttgtcatgattttcgtttacaacaaccttttccttctctatatcattatcacccttagtggtgtcatcagcttcttgcatctctgcttccttggtctcctcttctttttcttcctgggaaatttccttttgtgaagctgatgatcttttagtacgcttctttgggggctccctctgtgttggaggagctgccttggccttctcactgattcttgtagatcttcttggggtctcaccagtgccccagtcaaattctgatacagctgggcctccagggtgtgctttcaaatatttttccagctgcttcctgttattgatctcctctcctgttggtgcagtgaacacaatctcgtttttctttggggtaccagctttctttggaatgaactgcttcttccaaccaggtggagcaggaagctccaaagacaaagtttcctcgctcgcgccaccctccttctccactgcgctcgccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgca601ccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctg651cttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccag1051cgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaa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构件重组质粒过程中，可以包括以下步骤：

将目的基因片段和经过双酶切的pet-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5μlt4连接酶，1μl10×buffer，用水补齐至10μl，16℃连接过夜。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：基因的克隆

根据pmd19-t载体和基因的序列特点引入相应酶切位点的同源序列，在基因的上下游引物的5’端分别引入核酸内切酶(ndei)和(xhoi)两端的同源序列。

引物：f：3’-atggcgagcgcagtggagaag(ndei)-5’；

r：3’-tcagctctcgtgagtgccattc(xhoi)-5’。

以基因的f和r作为引物，以大豆r0期胚根cdna为模板，进行pcr扩增。反应体系为5×phusionhfbuffer4μl，2.5mmdntp1.6μl，上下游引物各10mm，cdna模板1μl，dmso0.6μl，用水补齐至20μl。在pcr仪上98℃预反应30s，98℃反应5s，退火温度依据引物tm值而定，72℃延伸反应时间依据基因长度而定，72℃10min，将反应产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上分离pcr产物，用紫外灯检测，并按照核酸回收试剂盒的说明书操作收集特异性扩增产物。将扩增回收产物与takara的pmd19-tsimple载体按照摩尔比10:1的比例混合，加入等体积的solutionⅰ反应缓冲液，混匀后，轻微离心，置于16℃下水浴连接过夜。

本实施例中，是根据ncbi数据库中的核酸序列设计引物，以大豆胚根总cdna为模板，利用pcr方法扩增挑选出来的基因的序列，pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，拟扩增基因得到有效扩增，基因的分子量大小与预期分子量大小相近(如图1所示)，连接t载后进行测序。将测序成功的克隆载体与蛋白表达载体pet-28a经双酶切后，通过t4连接酶连接酶切产物，构建pet-28a/重组质粒，然后将重组质粒转化大肠杆菌bl21star，利用菌落pcr法对重组菌进行验证(如图2所示)。结果显示构建成功的重组菌能扩增到目的片段，表明成功构建含目的基因的原核表达载体。

实施例2：超级感受态的制备及转化

按照上海生工提供的超级感受态试剂盒提供的方法制备大肠杆菌top10和bl21star感受态，在超净工作台中挑取划线培养的大肠杆菌单克隆菌株于5ml的lb液体培养基中，在37℃，180rmp恒温摇床中培养12h后，按照1:50比例接种到50ml新鲜配制的lb培养基中，至od600值约为0.6。将用50ml离心管收集菌体，8,000g离心3min。弃上清后将菌体冰上放置10min，4℃，5,000rmp离心5min，用试剂盒提供的buffera将菌体重悬后于冰上放置30min，4℃，5,000rmp离心5min，弃上清液，用试剂盒提供的bufferb(用前-20℃预冷)重悬菌体，用灭菌的1.5mlep管分装，每管100μl。在-80℃冰箱中备用。

将10μl连接产物加入到含有100μl大肠杆菌感受态中，轻微混匀。将大肠杆菌感受态细胞放置于冰上30min，42℃热激90s，冰上5min，加入900μl新鲜配制的lb液体培养基。在37℃，180rmp恒温摇床中培养1h，取300μl菌液涂布于含有相应抗生素的lb固体培养基中，37℃下倒置培养15h。

实施例3：质粒提取

利用omega公司提供的质粒提取试剂盒操作，取1ml菌液于1.5ml的ep管中，8,000rmp，离心1min，重复3次，弃上清。向装有菌体的ep管中加入bufferi200μl，用移液器充分吹打混匀后加入200μlbufferii，轻微颠倒混匀2次，室温静置1min，加入bufferiii300μl，颠倒混匀3次，整个过程不要超过5min。室温，12,000rmp离心15min，吸取上清500μl，加入平衡好的核酸收集柱中，室温，12,000rmp离心1min，弃废液后向核酸收集柱中加入500μlhbbuffer，室温12,000rmp离心1min，弃废液，加入试剂盒中的600μlwbbuffer(预先加入800ml无水乙醇)，室温12,000rmp离心1min重复2次，将核酸收集柱空转，15,000rmp离心2min除去残留的wbbuffer。向核酸收集柱内加入30μl无菌水，用一个新ep管收集质粒，室温12,000rmp离心2min。

实施例4：蛋白表达载体的构建

将含目的基因的pmd19-t载体按照基因引物设计的酶切位点做双酶切反应，反应体系为限制性内切酶各1μl，质粒1μg，反应buffer2μl，用水补齐至10μl，反应5h，将反应产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上分离酶切产物，在紫外灯下检测。回收目的基因片段，将目的基因片段和经过双酶切的pet-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5μlt4连接酶，1μl10×buffer，用水补齐至10μl，16℃连接过夜。

实施例5：重组子的菌落pcr验证

将连接产物转化大肠杆菌bl21star感受态细胞，挑取少量长有转化子的菌斑为模板，以引物来验证重组子，pcr反应体系与过程同基因克隆。

在本实施例中，将构建成功的pet-28a/蛋白重组菌扩大培养，加入0.1mmiptg在16℃下诱导12小时，离心收集菌并用balancebuffer重悬菌体，通过超声破碎重组菌的细胞膜离心取上清液即为重组菌的总可溶性蛋白，以pet-28a空载体诱导前后为对照，如图3所示，其中，1-4分别为bl21诱导前，bl21诱导后，17号蛋白诱导前，17号蛋白诱导后(理论分子量为12.3kda)。从结果可以看出经过sds-page电泳检测重组菌得到表达。

实施例6：500mm盐胁迫下重组菌的存活率的测定

将重组质粒转化菌和空载体转化菌接入含1‰卡钠(10mg/ml)的5mllb液体培养基中，在200rpm/min37℃的摇床中过夜培养；第二天转接至含1‰卡钠(10mg/ml)的5mllb液体培养基中，在200r/min37℃的摇床中扩培；将菌液浓度扩培至od600＝0.6—0.8之间后(重组质粒转化菌和空载体转化菌的od600需调至一致)，以1‰的比例加入浓度为4.8mg/mliptg，在200r/min30℃的摇床中诱导4h，再测其od600(将重组质粒转化菌和空载体转化菌的od600需调至一致)并记录。

将诱导后的菌液稀释10、100、1000倍后，分别取100ul涂布在有500mmnacl的高盐lb固体培养基(含1‰的卡纳(10μg/ml，1‰的比例)，含iptg(4.8mg/ml，1‰的比例))和正常lb固体培养基(含1‰的卡纳(10μg/ml)和iptg(4.8mg/ml))；正常lb固体培养基在37℃培养箱中培养15h后，记录能够进行计数的平板上的菌斑数目(平板菌落数在30-300个之间为有效数据)，高盐培养基在37℃培养箱中培养48h后记录菌斑数目(平板菌落数在30-300个之间为有效数据)，最后计算存活率，绘制存活率柱形图。

图4和图5分别为空载体转化菌和重组质粒转化菌在不同浓度的高盐lb固体培养基和正常固体培养基的生长结果图，其中，10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4分别表示稀释倍数1、10、100、1000。图6为空载体转化菌和重组质粒转化菌的存活率柱形图，其中，p值为为0.0261、glyma06g25310.1蛋白的标准差为0.1961、空载的标准差为0.0143。

本实施例中将重组菌诱导后稀释分别涂布在正常和高盐的平板上，对菌斑数目进行计数(平板菌落数在30-300个之间为有效数据)；以空载重组菌作为对照，计算重组菌的存活率。结果显示，与空载重组菌的存活率对比，可证明重组菌中的对应蛋白是否具有耐盐性。表达glyma06g25310.1蛋白的重组菌的存活率明显高于空载重组菌(如图6)，另外还进行了点板，更直观的显示了glyma06g25310.1蛋白的重组菌的存活率比空载重组菌的存活率更高(如图4和5)，证明该蛋白是具有一定的耐盐性。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

sequencelisting

<110>深圳大学

<120>大豆蛋白及其编码基因的应用及引物、表达载体和制备方法

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1408

<212>dna

<213>大豆（glycinemax(linn.)merr.）

<223>基因编码为glyma06g25310.1的大豆蛋白基因序列

<400>1

atcgaatcgacctgaactgcttcttcaaatttttttctggtgattctacaacctgtccta60

actctcaaccctcttcctcttaattaatctattcctctttatcctcctctgaacctcaaa120

caccaaaacaaagcattacaattctcaatttcacataaacaccagaattgataaaaacac180

ataacaaaaaaaaaaagtgaaaaatggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcg240

aggaaactttgtctttggagcttcctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaa300

agaaagctggtaccccaaagaaaaacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggaga360

tcaataacaggaagcagctggaaaaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtat420

cagaatttgactggggcactggtgagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaagg480

ccaaggcagctcctccaacacagagggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcag540

cttcacaaaaggaaatttcccaggaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgc600

aagaagctgatgacaccactaagggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaa660

acgaaaatcatgacaagagtgtggaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggag720

aagaagctaaagctggagaaaacgttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctg780

ctgatggagaactacctgcattaaaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctg840

aagtttttctgagaaaggatgaagaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaat900

atagtggatttggggagccagagaaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttg960

aagtggaaggagtgaataaagaggatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttgggg1020

aaatagaaggaacaaaagtgaacggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaagg1080

ccgaagcagagttgactgtgaatggcactcacgagagctgaactggtgaggtcaaaagcc1140

tggagcagggaatagattaataagctctccgcttccctcctctcattctgacccctttag1200

atctgtttgaaatgactgtagtttttgttaatgttatttctctgattgtttattgaaata1260

acaatatacaattatagagcatagccgtatcatgtaccacccttgggtgtattggacaga1320

cgtgtagcttctagttgcttttgtaacattatgttgtaagatgtgatatggacctgtaat1380

catatatgtaaggaagtgatcctatata1408

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>引物序列

<400>2

atggcgagcgcagtggagaag21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>引物序列

<400>3

tcagctctcgtgagtgccattc22

<210>4

<211>918

<212>dna

<213>人工序列

<223>目的基因片段的基因序列

<400>4

atggcgagcgcagtggagaaggagggtggcgcgagcgaggaaactttgtctttggagctt60

cctgctccacctggttggaagaagcagttcattccaaagaaagctggtaccccaaagaaa120

aacgagattgtgttcactgcaccaacaggagaggagatcaataacaggaagcagctggaa180

aaatatttgaaagcacaccctggaggcccagctgtatcagaatttgactggggcactggt240

gagaccccaagaagatctacaagaatcagtgagaaggccaaggcagctcctccaacacag300

agggagcccccaaagaagcgtactaaaagatcatcagcttcacaaaaggaaatttcccag360

gaagaaaaagaagaggagaccaaggaagcagagatgcaagaagctgatgacaccactaag420

ggtgataatgatatagagaaggaaaaggttgttgtaaacgaaaatcatgacaagagtgtg480

gaagatacagatgtcaacaaatccactcgttatggagaagaagctaaagctggagaaaac540

gttgaggtacctattgaagaggaaaaatccaatgctgctgatggagaactacctgcatta600

aaagataaagctgatgacaaagtaactgagggctctgaagtttttctgagaaaggatgaa660

gaaaagattgagcaaccacaggaagagacaaaagaatatagtggatttggggagccagag720

aaattggaaacatgcactactgcagacaaaacggttgaagtggaaggagtgaataaagag780

gatcacgtcaaaagtactcatgaatttgaagttggggaaatagaaggaacaaaagtgaac840

ggtgaagaacatcacaagcttgatgagataaacaaggccgaagcagagttgactgtgaat900

ggcactcacgagagctga918

<210>5

<211>6177

<212>dna

<213>人工序列

<223>pet-28a重组质粒基因序列

<400>5

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaa60

ggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctt120

tgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgaggcttcggccttgtttat180

ctcatcaagcttgtgatgttcttcaccgttcacttttgttccttctatttccccaacttc240

aaattcatgagtacttttgacgtgatcctctttattcactccttccacttcaaccgtttt300

gtctgcagtagtgcatgtttccaatttctctggctccccaaatccactatattcttttgt360

ctcttcctgtggttgctcaatcttttcttcatcctttctcagaaaaacttcagagccctc420

agttactttgtcatcagctttatcttttaatgcaggtagttctccatcagcagcattgga480

tttttcctcttcaataggtacctcaacgttttctccagctttagcttcttctccataacg540

agtggatttgttgacatctgtatcttccacactcttgtcatgattttcgtttacaacaac600

cttttccttctctatatcattatcacccttagtggtgtcatcagcttcttgcatctctgc660

ttccttggtctcctcttctttttcttcctgggaaatttccttttgtgaagctgatgatct720

tttagtacgcttctttgggggctccctctgtgttggaggagctgccttggccttctcact780

gattcttgtagatcttcttggggtctcaccagtgccccagtcaaattctgatacagctgg840

gcctccagggtgtgctttcaaatatttttccagctgcttcctgttattgatctcctctcc900

tgttggtgcagtgaacacaatctcgtttttctttggggtaccagctttctttggaatgaa960

ctgcttcttccaaccaggtggagcaggaagctccaaagacaaagtttcctcgctcgcgcc1020

accctccttctccactgcgctcgccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtg1080

atgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaatta1140

tttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcg1200

cgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccac1260

aggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgcca1320

cttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccggggg1380

actgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcct1440

caacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcc1500

cggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagaga1560

gtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccg1620

gtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaa1680

cgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcac1740

aacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgc1800

acgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcg1860

tggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatc1920

ttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca1980

ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccaga2040

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tggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcgg2160

cgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatag2220

cggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctga2280

atgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaa2340

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cgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggttt2640

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gcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgta2820

ggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcg2880

acgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttc2940

gtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcg3000

gccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggt3060

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tgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccc3300

tgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgt3360

tccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttc3420

atcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaa3480

caggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctg3540

gagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgac3600

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tgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcaga3720

caagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccag3780

tcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtac3840

tgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccg3900

catcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcg3960

gcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataa4020

cgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgc4080

gttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctc4140

aagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaag4200

ctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttct4260

cccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgta4320

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cttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggc4440

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gaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgc4620

tggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctca4680

agaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgtta4740

agggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtg4800

ttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatgg4860

atgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaa4920

tctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggta4980

gcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgc5040

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aagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttct5400

cacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgag5460

tcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagtttt5520

ctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaata5580

aattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagcggatac5640

atatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaa5700

gtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaa5760

atcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaa5820

tagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaac5880

gtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaa5940

ccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccct6000

aaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaa6060

gggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgc6120

gtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca6177