一种SYBRGreenI闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法与流程

本发明公开了胶原蛋白的来源的检测方法，尤其是一种sybrgreeni闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法。

背景技术：

胶原蛋白是一种生物性高分子物质，是现今哺乳动物各组织器官中含量最为丰富、覆盖面积最大的一种蛋白质。因其具备营养以及生理调节双重作用，被广泛的应用于医疗、食品、化妆品及包装材料等各领域。目前，市售的传统胶原蛋白主要来源于猪、牛等陆生动物，但在伊斯兰教中，含有猪明胶的非清真产品是严格禁止的，而对于牛胶原蛋白而言，由于口蹄疫及疯牛病的影响，其生产销售也在一定程度上受到了限制。近年来，水产胶原蛋白因其优良的理化特性和生理活性功能渐渐成为市售胶原蛋白最主要来源之一，但水产胶原蛋白价格较高，市场上出现以猪牛等胶原蛋白掺假冒充水产胶原蛋白的情况。

为解决上述宗教以及食品造价问题，国内外学者先后采用了色谱及氨基酸组成分分析法、多克隆间接竞争elisa法、质谱法以及种属特异性pcr方法对蛋白来源进行了鉴定，但操作流程复杂，实验所需仪器较为昂贵。lamp技术作为众多核苷酸扩增技术中的一种，是日本学者notomi于2000年在nucleicacidsres杂志上公开的一种新型基因诊断技术。该技术依赖一种具有链置换特性的bstdna聚合酶，通过四条能够识别目标序列上六个特异性区域的引物，实现等温快速扩增，可在1h之内，将目标序列dna扩增10⁹-10¹⁰倍。lamp法自发明以来因其特异性强、灵敏度高、反应迅速、操作便捷等优势被广泛应用于微生物、病毒以及动植物的检测中。

本发明在lamp的基础上对其进行可视化操作，增强其实用性，并采用蜡封反应管从源头消除lamp反应可能带来的阳性污染。研究中所使用的sybrgreeni染料是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。当dna样品未发生特定的lamp反应时，染料显淡橙色或无色，当lamp反应发生时，样品则呈现荧光绿的颜色。。整个操作过程所需要的仪器设备简单，时间短，仅需2小时左右，该检测方法经济实惠，方便快捷，适合基层快速检测。

技术实现要素：

为了实现对市售对胶原蛋白及明胶来源的检测的目的，本发明提供一种sybrgreeni闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶的方法，可快速鉴定水产胶原蛋白及明胶以及对食品、化妆品中胶原蛋白添加成分，本发明提出了一种sybrgreeni闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法，其技术方案如下：

一种sybrgreeni闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)制备含有sybrgreeni染料的微晶蜡封反应管；(2)手工提取或使用试剂盒进行提取样品dna；(3)样品dna于蜡封反应管进行lamp反应，反应时设置去离子水为空白对照组；(4)lamp反应后将反应管迅速置于水浴锅中终止反应，观察颜色变化以此判断待测样品，阳性出现荧光绿色，阴性则出现淡橙色或无色。

进一步的，所述sybrgreeni染料用量为0.05-5.00μl(1000x)。

进一步的，所述微晶蜡用量为0.01-1.00g，将含有染料和微晶蜡的反应管置于水浴锅中升温60-100℃，1-10min去除，室温冷却制得蜡封反应管。

进一步的，所述lamp反应体系包括1xthermopol缓冲液0.05-5.00μl，mgso41-10mm，dntps1-10mm，betaine溶液0.1-1.0m，1-10ubstdna聚合酶，1-100umol/l的外引物f3和b3各0.1-10μl，1-100umol/l的内引物fip和bip各1-10μl以及1-10μl模板dna，1-100umol/l环引物lf及lb用量为0.1-10μl，灭菌水至10-100μl。

进一步的，lamp反应条件为50-100℃水浴锅中反应20-200min，所述终止反应条件为60-100℃水浴锅中灭活10-100min。

进一步的，所述lamp反应引物序列经软件primerexplorerv5设计获得。

本发明与现有技术相比，有如下优点：

使用lamp技术对胶原蛋白样品进行检测，其检测结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断，相比于其它检测技术，本方法对实验所需设备要求较低，操作过程较为简单，适用性较强，避免了传统检测方法对仪器和试剂要求高的缺点，本发明在lamp的基础上对其进行可视化操作，增强其实用性，采用蜡封反应管从源头消除lamp反应可能带来的阳性污染，同时使用的sybrgreeni染料是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，当dna样品未发生特定的lamp反应时，染料显淡橙色或无色，当lamp反应发生时，样品则呈现荧光绿的颜色，整个操作过程所需要的仪器设备简单，时间短，仅需2小时左右，该检测方法经济实惠，方便快捷，适合基层快速检测。

附图说明

图1为微晶蜡闭管检测方法对鳕鱼胶原蛋白的检测结果。

其中，微晶蜡封反应管从左至右排列依次是：鳕鱼胶原蛋白、鮰鱼胶原蛋白、猪肉、牛肉、猪明胶、牛明胶、牛胶原蛋白、水。盛放鳕鱼胶原蛋白的第一支反应管颜色成绿色，其他均为淡橙色。

图2为微晶蜡闭管检测方法对斑点叉尾鮰胶原蛋白的检测结果。

其中，微晶蜡封反应管从左至右排列依次是：鮰鱼胶原蛋白、鳕鱼胶原蛋白、猪肉、牛肉、猪明胶、牛明胶、牛胶原蛋白、水。盛放鮰鱼胶原蛋白的第一支反应管颜色为绿色，其他均为淡橙色。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明：

一种sybrgreeni闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法，包括如下步骤：

(1)制备含有sybrgreeni染料的微晶蜡封反应管：

微晶蜡固定样品称重约0.01-1.00g覆盖于含有sybrgreeni染料(0.05-5.00μl，1000x)反应管的液面上，将反应管放入水浴锅中，升温至60-100℃，1-10min中后取出，室温下冷却凝固。

(2)手工提取或使用试剂盒进行提取样品dna：

取胶原蛋白样品100mg-20g，手工提取dna或使用试剂盒进行dna提取，具体操作步骤按照试剂盒或者试剂的说明书进行。

(3)lamp反应，反应时设置去离子水为空白对照组：

取1-10μl提取的dna，加入pcr管中，同时在其中加入1xthermopol缓冲液0.05-5.00μl，mgso41-10mm，dntps1-10mm，betaine溶液0.1-1.0m，1-10ubstdna聚合酶，1-100umol/l的外引物f3和b3各0.1-10μl，1-100umol/l的内引物fip和bip各1-10μl以及1-10μl模板dna，1-100umol/l环引物lf及lb用量为0.1-10μl，灭菌水至10-100μl，反应体系配制完成后，将反应管放入可悬浮泡沫塑料微型管架中置于50-100℃水浴锅中反应20-200min。

(4)lamp反应后将反应管迅速置于水浴锅中终止反应：

取出反应管，迅速置于60-100℃水浴锅中反应10-100min终止实验，观察其颜色变化阳性出现荧光绿色，阴性则出现淡橙色或无色。

实施例1：

鳕鱼胶原蛋白检测：

(1)微晶蜡反应管的制备：微晶蜡固定样品称重约0.05g覆盖于含有sybrgreeni染料(0.05-5.00μl，1000x)反应管的液面上，将反应管放入水浴锅中，升温至60℃，10min中后取出，室温下冷却凝固。

(2)dna提取：取鳕鱼胶原蛋白样品200mg，使用dneasymericonfoodkit试剂盒进行dna提取，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

(3)lamp反应：取5μl提取的dna，加入pcr管中，同时在其中加入1xthermopol缓冲液5.00μl，mgso410mm，dntps10mm，betaine溶液1.0m，10ubstdna聚合酶，100umol/l的外引物f3和b3各10μl，100umol/l的内引物fip和bip各10μl以及10μl模板dna，100umol/l环引物lf及lb用量为10μl，灭菌水至100μl。反应体系配制完成后，将反应管放入可悬浮泡沫塑料微型管架中置于100℃水浴锅中反应100min，其中：

(4)取出反应管，迅速置于100℃水浴锅中反应100min终止实验，观察其颜色变化。反应管中样品变为绿色的为阳性样品，显色为淡橙色或无色的为阴性样品。

实施例2：

鳕鱼明胶检测：

(1)微晶蜡反应管的制备：微晶蜡固定样品称重约1.00g覆盖于含有sybrgreeni染料(0.05-5.00μl，1000x)反应管的液面上，将反应管放入水浴锅中，升温至100℃，10min中后取出，室温下冷却凝固。

(2)dna提取：取鳕鱼明胶样品2g，使用dneasymericonfoodkit试剂盒进行dna提取，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

(3)lamp反应：取10μl提取的dna，加入pcr管中，同时在其中加入1xthermopol缓冲液0.05-μl，mgso45mm，dntps5mm，betaine溶液0.5m，5ubstdna聚合酶，50umol/l的外引物f3和b3各5μl，100umol/l的内引物fip和bip各5μl以及5μl模板dna，100umol/l环引物lf及lb用量为5μl，灭菌水至100μl。反应体系配制完成后，将反应管放入可悬浮泡沫塑料微型管架中置于100℃水浴锅中反应100min，其中，

(4)取出反应管，迅速置于100℃水浴锅中反应100min终止实验，观察其颜色变化。反应管中样品变为绿色的为阳性样品，显色为淡橙色或无色的为阴性样品。

实施例3：

斑点叉尾鮰胶原蛋白检测：

(1)微晶蜡反应管的制备：微晶蜡固定样品称重约1.00g覆盖于含有sybrgreeni染料(0.05-5.00μl，1000x)反应管的液面上，将反应管放入水浴锅中，升温至100℃，8min中后取出，室温下冷却凝固。

(2)dna提取：取斑点叉尾鮰胶原蛋白样品100mg，使用dneasymericonfoodkit试剂盒进行dna提取，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

(3)lamp反应：取1μl提取的dna，加入pcr管中，同时在其中加入1xthermopol缓冲液2.5μl，mgso44mm，dntps2.0mm，betaine溶液0.2m，8ubstdna聚合酶，10umol/l的外引物f3和b3各0.625μl，10umol/l的内引物fip和bip各5μl以及模板dna1μl，1-100umol/l环引物lf及lb用量为0.1-10μl，补足灭菌水至25μl。反应体系配制完成后，将反应管放入可悬浮泡沫塑料微型管架中置于65℃水浴锅中反应2h，其中，

(4)取出反应管，迅速置于100℃水浴锅中反应100min终止实验，观察其颜色变化。反应管中样品变为绿色的为阳性样品，显色为淡橙色或无色的为阴性样品。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。