OSBPL1A基因及其编码蛋白的用途的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及osbpl1a基因及其编码蛋白的用途。

背景技术：

结核病(tuberculosis,tb)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。尽管目前已有有效的抗结核药物，但结核病仍然是当前感染性疾病的头号杀手，全球每年约200万人死于结核病；全球约三分之一的人口感染结核分枝杆菌，在这些被称为结核菌潜伏感染(ltbi)的人群中，有约10％最终将进展为活动性结核病。

由于目前缺乏有效的结核病疫苗，结核病的预防控制主要依赖于早期发现、治疗、隔离活动性结核病人。然而，现今诊断活动性结核病的检测技术存在严重不足，不能满足临床和结核病预防控制的要求：1)痰结核分枝杆菌微生物检查特异性高，是当前诊断活动性肺结核的金标准，但存在敏感性低(不足40％)，耗时长(结核菌培养耗时1－2个月)，实验室生物安全要求高的缺点。2)结核分枝杆菌基因检测，虽然实现了快速诊断的目的(1天)，但直接从痰标本进行的基因检测在敏感性方面没有显著提高，且存在假阴性，假阳性的问题。3)免疫学检测中抗体检测被世界卫生组织认定不适合结核病的诊断；细胞免疫学检测包括结核菌素皮试(tst)和结核菌干扰素释放试验(igra)，不能有效区分活动性结核患者和结核菌潜伏感染者，虽然后者在活动性结核患者检测的敏感性显著高于其他检测。

osbpl1a(氧固醇结合蛋白样1a)是一种蛋白质，是由osbpl1a基因编码。这个基因编码的氧化固醇结合蛋白家族成员(osbp)是一组细胞内脂质受体。这个蛋白家族的大多数成员包含一个n端ph结构域和一个高度保守的c-末端osbp样固醇结合域，但是有些成员只包含甾醇结合域。目前发现结核病人可表达osbpl1a，然而其在结核中的作用机制并不清楚。尚没有关于osbpl1a基因作为结核诊断标志物的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种osbpl1a基因及其编码蛋白用于结核潜伏感染和活动性结核的分子标志物的用途。

为实现上述目的，本发明提供一种osbpl1a基因及其编码蛋白的用途，其特征在于，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品的用途。

进一步，所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：用实时定量pcr或基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。

进一步，所述用实时定量pcr判别结核潜伏感染和活动性结核的产品至少包括一对特异扩增osbpl1a基因的引物。

进一步，所述特异扩增osbpl1a基因的引物序列如seqidno:1和seqidno:2所示。

seqidno:1为(5'—3')ctgccacgtttgacgcttac；记为osbpl1af；

seqidno:2为:(5'—3')cactttcagaatccggcact；记为osbpl1ar。

进一步，所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括：与osbpl1a基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的osbpl1a基因及其编码蛋白的用途即可作为判别结核潜伏感染和活动性结核的分子标志物。

利用本发明可以检测osbpl1a基因的表达情况，从而判别是否患有活动性结核病。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发dna合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即dna聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15～25个核苷酸之间。

在本发明中，所述探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

经实验证明，本发明osbpl1a基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群，因此osbpl1a基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

附图说明

图1是本发明实施例1的osbpl1a基因在人外周血单个核细胞(pbmc)中差异表达的定量rt-pcr结果图。

图2是osbpl1a基因在pbmc中差异表达的芯片结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

本实施例将人群分为三组：本实施例将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和健康人群(各20例)，通过检测每例外周血单个核细胞(pbmc)中osbpl1a基因mrna变化，发现其在治愈结核病人中呈明显的下调表达趋势。

本实施例用定量rt-pcr方法检测每例osbpl1a基因的表达变化。具体步骤如下：

步骤一：外周血单个核细胞(pbmc)悬液的制备

在离心管中加入淋巴细胞分离液(freseniuskabinorgeas:lys3773)5ml；取上述确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等体积量1m的磷酸缓冲液(pbs)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的1mpbs，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10％的的rpmi1640(thermo

scientific：sh30807.01b)1ml，重悬细胞，得到三组人群的各20例pbmc悬液；每例取20μl的pbmc悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。

步骤二：rna抽提

采用qiagene公司的rneasyminikit(货号74106)对上述得到的三组人群的各20例pbmc悬液进行rna抽提。具体操作是：取上述含1×106个细胞的pbmc悬液于去dna酶和rna酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350μlbufferrlt，充分混匀裂解；加入250μl无水乙醇，混匀，把液体转移到rneasy柱子中，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μlbufferrw1以8,000g离心30秒，弃废液；加入80μldnase溶液(10μldnase+70μlbufferrdd)，柱上消化15min，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μlbufferrw1，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μlbufferrpe，8,000g离心30秒，弃废液；空甩，8,000g离心1分钟；把柱子转移到一个去dna酶和rna酶的1.5ml离心管，加入40μl无rnase的ddh2o，10,000g离心1分钟，收集三组人群的各20例的rna于-80℃保存、待用。

步骤三：反转录

采用takara公司的反转录试剂盒(drr047)，取步骤二得到的rna0.5μg进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组dna的步骤，可在最大程度上保证rna的纯度和扩增的特异性。

分步如下:

(1)基因组dna的去除反应

42℃温浴2min，于4℃下保存。

(2)反转录反应

反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：

37℃温浴15min，85℃放置5秒，反应完放4℃保存。

步骤四：荧光定量pcr反应

模板：上述反转录产物作为荧光定量pcr反应的模板，模板用量为1μl。利用osbpl1a基因(nm_080597.2)和gadph基因(nm_002046.4)序列，设计两对引物。由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列如下：

通过上述osbpl1a上下游引物，得到的pcr产物长度为120bp；通过gadph上下游引物，得到的pcr产物长度为243bp。

pcr反应的体系：

pcr反应采用takara公司的premixextaqtmii(货号：drr081d)，此产品能够抑制非特异性反应，在宽广的范围内进行更加准确的定量。本buffer和改良后的hot

start法用dna聚合酶takaraextaqhs组合使用，可以进行再现性好、可信度高的realtimepcr解析。

使用仪器为abi7500实时荧光定量pcr仪进行实时定量pcr反应。

实时定量pcr反应采用两步法pcr，扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。

根据实时定量pcr的结果，用abi7500softwarev2.0.6对结果进行处理分析，以gadph基因为内参基因，利用2^-δδct的方法计算出结核患者和潜伏感染人群相对于健康人群的表达量，结果如图1、2所示，其中横坐标表示不同的人群，纵坐标表示相对表达量(rq)，纵坐标越大表明其表达水平越高，结果表明，osbpl1a在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表达水平(见图1)，差异显著(p<0.05)。在图1中，“tb”指活动性结核感染者，“ltbi”指潜伏性结核感染者，“hc”指健康对照。

根据上述实验结果，可通过定量rt-pcr诊断结核潜伏感染和活动性结核：设计osbpl1a基因的pcr引物，检测结核组织中osbpl1a基因的表达量，如果osbpl1a的表达量显著升高，则说明患结核的可能性高，反之则低，以更好的区分活动性结核感染者与潜伏性结核感染者。

实施例2

本实施例将人群分为三组：结核病患者9例，潜伏感染人群和健康人群均6例，通过基因芯片检测每例外周血单个核细胞(pbmc)中osbpl1a基因mrna变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。

本实施例用基因芯片检测结核样本中osbpl1a基因在tb、ltbi、和hc中基因表达水平的差异，包括如下四个步骤：

步骤一：芯片制备

目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列在载体上，靶基因可分为基因组dna、cdna(或人工合成dna)。

步骤二：样品制备

待测样品中总rna的抽提步骤如下：分别分离结核病患者、潜伏感染者以及健康人群的pbmc，再用qiagenerna提取试剂盒提取总rna(其具体方法参照实施例1)，提取的总rna进一步用于样品cdna探针制备，其过程包括荧光cy3和cy5探针的制备(cdna第一链标记)、纯化和定量，定量后的cy3和cy5标记的探针吸回至1.5ml离心管中，加热抽干，保存于-20℃，待杂交。

所述定量后的cy3和cy5标记的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物，探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

步骤三：芯片杂交

1)准备：(1)洗涤盖玻片，将盖玻片依次放入ddh2o、95％乙醇、ddh2o，各3min，最后放入干燥的50ml离心管中1000转/分，离心3min，去除残留的水渍，放置待用；(2)配制0.1m的pbs溶液；(3)平衡杂交炉，用水平仪校准杂交炉，保持水平；(4)配制如下洗片液：20×ssc溶液、10％(m/v)sds溶液、洗液i(2×ssc/0.5％(m/v)sds)、洗液ii(1×ssc/0.1％(m/v)sds)、洗片溶液iii(0.1×ssc)。

2)预杂交配制预杂交液30μl(由9μl的20×sspe缓冲液、3μl的50×denhandts缓冲液和18μlddh2o组成)，取出芯片，将30μl预杂交液滴加于芯片上，盖上盖玻片，然后将芯片放入加有0.1mpbs的杂交盒，置于42℃杂交炉中预杂交1小时，预杂交完成之后取出芯片用ddh2o浸洗片刻，待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心，去除残留的水渍，即得到预杂交的芯片。

3)杂交取出经定量的cy3和cy5标记的探针1～5μl，各用9～15μlddh2o充分溶解混合于1.5ml离心管内，然后在此离心管继续加入cy3/cy5荧光标记探针的杂交液(由9μl的20×sspe缓冲液、3μl的50×denhandts缓冲液和18μlddh2o组成)得到杂交混合液，接着取杂交混合液滴加在预杂交的芯片上，并盖上盖玻片得到杂交芯片，最后将该杂交芯片放入加有0.1mpbs的杂交盒，置于42℃杂交箱中杂交12～20小时。

步骤四：信号检测

芯片杂交反应结束后，进行芯片洗涤，再通过扫描仪如激光共聚焦扫描仪进行扫描，扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号，用genpixpro6.0软件读取芯片数据，genepixpro6.0通过芯片的背景噪音以及杂交点的光强度分析，对每个点的光强度值校准，并将每个杂交点的光强度转化为数据值。

为了研究osbpl1a在三个不同人群中的变化情况，我们采取了onewayanova结合bonferroni相关系数的分析方法，阈值设置为p<0.05，最终经分析，由基因芯片检测结核中osbpl1a基因的表达差异，红色代表基因表达上调，绿色代表基因表达下调(图2中标识a代表红色，标识b代表绿色；“tb”指活动性结核感染者，“ltbi”指潜伏性结核感染者，“hc”指健康对照)。结果显示在结核病人中osbpl1a基因表达显著上调，而在ltbi和hc中，osbpl1a的表达量都是下调的。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

sequencelisting

<110>陈心春

<120>osbpl1a基因的用途

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ctgccacgtttgacgcttac20

<210>2

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工合成

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ttaaaagcagccctggtgac20