贺兰山紫蘑菇中提取的大黄素甲醚抗菌和抗氧化实验方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种贺兰山紫蘑菇中提取的大黄素甲醚抗菌和抗氧化实验方法。

背景技术：

贺兰山紫蘑菇(cortinariusrufo-olivaceus)是一种以丝膜菌为主的纯天然野生菌，其气味醇香、肉质鲜嫩，含有丰富的粗纤维、总糖、蛋白质及17种游离氨基酸，被称之为“贺兰山珍”。前期实验发现，贺兰山紫蘑菇的粗提物有良好的抑菌性和抗氧化性。通过柱层析、制备薄层层析和重结晶方法等分离纯化，从贺兰山紫蘑菇石油醚提取物中分离得到大黄素甲醚针状晶体。大黄素甲醚属于蒽醌类化合物，别名朱砂莲乙素；1,8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式是c16h12o5。因此实验以大黄素甲醚为研究材料进行抗菌和抗氧化研究，为以后对贺兰山紫蘑菇的进一步研究开发打下基础。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种贺兰山紫蘑菇中提取的大黄素甲醚抗菌和抗氧化实验方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括原料：分离自贺兰山紫蘑菇石油醚提取物的大黄素甲醚晶体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑根霉、黑曲霉；

试剂：二甲基亚砜、dpph、标准vc、硫酸亚铁、30％双氧水、水杨酸、盐酸、tris粉、邻苯三酚、无水乙醇；

主要实验仪器：ar224cn型电子天平、yxq-ls-100a型立式压力蒸汽灭菌器、vs-1300型洁净工作台、uv-1100型紫外可见分光光度计；s.c.101型鼓风电热恒温干燥箱、dk-s24型电热恒温水浴锅；

实验步骤：

(1)配制溶液：用二倍稀释法将大黄素甲醚和标准vc浓度配制为512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml进行抗菌和抗氧化实验；

(2)用牛津杯法进行定性实验；用二倍稀释法进行最小抑菌浓度测定；用梯度稀释法计算抑菌率；

(3)抗氧化检测所需溶液配制：

1)dpph·的清除实验：用无水乙醇配制浓度为0.08mmol/l的dpph溶液，避光保存，备用；

2)超氧阴离子自由基(o2－·)的清除实验：配制浓度为0.05mmol/ml的tris-hcl缓冲液，0.025mmol/ml的邻苯三酚溶液，8mol/l的hcl溶液，备用；

3)羟自由基(·oh)的清除实验：配制浓度为0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液，0.009mmol/ml的水杨酸-乙醇溶液，0.03％的h2o2溶液，备用；

抗氧化检测：

样品制备：将大黄素甲醚晶体溶于dmso溶剂中，并于30℃水浴锅中保温使其完全溶解，用二倍稀释法将样品配成有浓度梯度的待检测样品溶液编号备用，同样将抗坏血酸配成相同浓度梯度的待检测溶液编号备用；

抗氧化实验：

样品对dpph·的清除实验：分别取2.0ml各个浓度梯度的待测样品液到试管中，再加入2.0ml浓度为0.08mmol/l的新配制的dpph·溶液，然后混合均匀，使其反应30min后，在波长为517nm处用分光光度计检测其吸光度ai，同时测定样品本底颜色的吸光度aj以及不加样品液的空白对照的吸光度ao，并以下式计算其清除率：

dpph·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

样品对超氧阴离子自由基(o2－·)的清除实验：用移液管精确取4.5mltris-hcl缓冲溶液，然后放入25℃水浴锅中预热20分钟，然后分别加入l.0ml各个浓度梯度的待测样品液和0.4ml浓度为0.025mmol/ml邻苯三酚溶液混合均匀，然后放入25℃水浴锅中反应5min，再加入1.0ml的8mol/lhcl溶液来终止反应，最后将溶液稀释10倍后在波长299mn处用分光光度计测定吸光度ai，以蒸馏水代替样品液作为空白对照，测定吸光度ao，同时用不加邻苯三酚溶液测得的吸光度aj代表样品的本底颜色，按下式计算清除率：

o2－·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

样品对羟自由基(·oh)的清除实验：分别加入1.0ml各个浓度梯度的待测样品溶液于试管中，加入1.0ml浓度为0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液和1.0ml0.03％h2o2溶液混匀，水浴锅中37℃孵育10min，再加入1.0ml浓度为0.009mmol/ml的水杨酸-乙醇溶液，混匀后37℃水浴锅中孵育30min，最后将溶液稀释10倍后在波长510nm处用分光光度计测定样品液的吸光度ai，以蒸馏水代替样品液作为空白对照，测定吸光度ao，用不加显色剂h2o2溶液测得的吸光度aj代表样品的本底颜色，计算方法如下式：

·oh清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

抗菌实验：对紫蘑菇的石油醚提取物中得到的疑似大黄素甲醚的物质分别进行核磁共振实验、用扫描电镜观察，确定为大黄素甲醚，用dmso将大黄素甲醚溶解，采用牛津杯法进行抗菌的定性实验，针对大肠杆菌测定最小抑菌浓度，并测定抑菌率，在电镜下观察处理后的细胞形态，分析其抗菌机理；

培养基的配置及分装：

①称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中；

②溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，用玻棒搅匀，加热溶解；

③在加琼脂后调ph值，用1mol/l的naoh或1mol/l的hcl调ph，用ph试纸对照；

④加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水；

⑤分装：在漏斗架上分装，根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的1/5特别注意不要使培养基粘污在管口上以免浸湿棉塞，引起污染；

⑥包扎成捆、挂上标签；培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签；

⑦灭菌备用；灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面；培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24h，如确无菌生长、方可使用；

二种培养基的配方及具体配制方法

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基是一种天然培养基，用于培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌；其中，牛肉膏提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，nacl提供无机盐；

以配置1000ml牛肉膏蛋白胨培养基为例；

准确称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，加入到盛有1000ml蒸馏水的锅中，充分搅拌使其溶解；再称取琼脂15.0-20.0g，剪成小段，加入到锅中，不断搅拌以防糊锅；琼脂充分溶解后，调节ph至7.4至7.6；用精密ph试纸测量，当ph偏小时，缓慢滴加浓度为1mol/l的氢氧化钠调节，而当ph偏大的时候，则滴加浓度为1mol/l的盐酸调节来ph；最后加水至1000ml定容；将配好的培养基分装，加塞包扎牢固，等待灭菌；

pda培养基：pda培养基的全程为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即potatodextroseagar(medium)；pda培养基属于半合成培养基；

以配置1000mlpda固体培养基为例；

新鲜土豆洗净后去皮，称取200.0g土豆，切成小块状，加入到盛有1000ml蒸馏水的锅中，煮30分钟左右，直至能用玻璃棒头部戳进土豆内，接下来用三层纱布过滤得到土豆汁，持续加热，加入15.0g-20.0g琼脂和葡萄糖20.0g；琼脂条应剪成小段以加速溶解；持续加热、不断搅拌，防止琼脂糊锅；煮的过程中应该持续关注锅内沸腾额状况，防止锅内液体溢出；

分装要求：

将配置好的培养基用皮管和漏斗分装到试管或者到锥形瓶中；分装时，培养基的液面不能超过试管高度的五分之一，灭菌后摆成平面；分装到锥形瓶中时，培养基的液面应该在锥形瓶高度的三分之一左右；

在分装过程中，应该要注意避免培养基沾在试管口或锥形瓶口，以免引起污染；给试管和锥形瓶塞上棉塞，包好牛皮纸，用棉绳捆好扎牢，以防止被外界微生物污染；在分装好的试管和锥形瓶外面要贴好标签，写清培养基的种类，配置日期等，以便识别；

灭菌：

在实验室的操作中，灭菌一般分为干热灭菌和湿热灭菌；干热灭菌法的灭菌温度为160℃，灭菌时间为4小时；干热灭菌法适用于耐高温的玻璃和金属制品；湿热灭菌法的灭菌条件为，温度为121℃时利用高压蒸汽灭菌锅灭菌20分钟；由于水蒸气的穿透性相对比较强，培养基的灭菌经常采用湿热灭菌法；

移液枪头、无菌水和准备好的培养基用报纸包好后，采用湿热灭菌法，以121℃，20min高压蒸汽灭菌，将牛津杯、培养皿用报纸包好后，采用干热灭菌法以160℃，4h干热空气灭菌；将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上摆放斜面；灭菌后的培养基放入37℃的温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底，灭菌彻底的培养基放于低温处备用；除培养基外湿热灭菌后的东西都要置于烘箱内干燥，防治潮湿导致微生物滋生；

菌种活化：使用无菌操作台前先要在无菌操作台打开紫外灯杀菌30min，杀菌时一般将除菌种外实验中会使用到的实验材料如牛津杯、移液枪、培养皿、接种环等放在无菌操作台上一起灭菌，用pda培养基斜面活化黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培养基活化大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；黑曲霉28℃光照培养2天、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37℃培养24h备用；霉菌操作完成必须严格杀菌后才能进行大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的操作；

以活化大肠杆菌为例；

第一步：取无菌培养基两副，在培养皿底部做好标记；取已经融化好的牛肉膏蛋白胨培养基倒入无菌培养皿中，制成平板；

第二步：带平板冷却凝固后，用接种环取大肠杆菌一环，进行活化；

菌种活化方法有二种：

连续划线法：将挑取有大肠杆菌的接种环在平板培养基表面作连续划法，勿划破培养基；划线完毕后，倒置于37℃培养箱培养；

平板涂布法：挑去适量大肠杆菌于无菌水中，轻轻震荡混匀，制成菌悬液；用移液枪吸取100μl于培养基，用涂布棒涂抹均匀；

抑菌定性试验操作：

取一定量的大黄素甲醚晶体溶解于二甲基亚砜，放置于超声仪中超声10分钟以加速溶解，配置成浓度为256ug/ml的大黄素甲醚溶液；

将制好的培养基融化，无菌操作台开紫外灯杀菌后，在无菌操作台上到平板，待培养基凝固后用活化后的黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培养基活化大肠杆菌、金黄色葡萄球菌制成菌悬液，然后用移液枪将菌悬液移取100ul到培养基上，用涂布棒涂布均匀；在涂布好的平板上，放上已经灭菌的牛津杯--每个培养皿放置2个，样品溶液一个，另一个放dmso做空白对照，在牛津杯内用移液枪移取200ul的实验材料溶液，然后在对照组内注入200ul的dmso，将完成的黑根霉、黑曲霉培养皿小心移入培养箱培养48h，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的培养皿移至37℃培养箱，培养24h，观察实验结果；

最小抑菌浓度测定的操作：

准备4个洁净干燥的25ml容量瓶，采用二倍稀释法配置得到系列浓度梯度的大黄素甲醚溶液；

4个容量瓶依次做好标记：256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，分别记为容量瓶1、容量瓶2、容量瓶3、容量瓶4；从容量瓶1中取出12.5ml浓度为256μg/ml大黄素甲醚溶液，加入到容量瓶2中，用dmso定容，混合均匀，得到浓度为128μg/ml的大黄素甲醚溶液；照此方法，依次得到浓度为64μg/ml、32μg/ml的大黄素甲醚溶液；

以浓度为256μg/ml的大黄素甲醚为实验对象为例；

取3个已倒完培养基的平板进行平行实验，避免出现实验的偶然性，减小实验误差；在3个培养基中分别打入大黄素甲醚溶液200μl，加入少量菌液，用涂布棒涂抹均匀；涂布完毕后稍稍静置，以免菌液流动；静置完毕后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于温度为37℃的培养箱中，培养24小时后，观察实验结果；

照此方法，对浓度为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml的大黄素甲醚溶液也分别进行实验；

抑菌率测定的操作：

以大肠杆菌为实验菌种，实验样品为浓度为上一步骤中得到的最小抑菌浓度；

准备14支已灭菌的试管备用，分为实验组和对照组；

用活化好的大肠杆菌制作菌悬液

实验组：

取大黄素甲醚溶液0.5ml，菌液0.5ml，加入到装有4.0ml无菌水的试管中，震荡，得到稀释10^-1的菌悬液；

另取装有4.5ml无菌水的试管6支，用记号笔边上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

从10^-1中取出0.5ml液体加入到10^-2中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10^-2菌液稀释液；同法由10^-2的试管中吸取0.5ml稀释液加入编号为10^-3的无菌水试管中，混匀后即为10^-3菌液稀释液，依次连续稀释至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀释液；

对照组：

取菌液0.5ml，加入到装有4.5ml无菌水的试管中，震荡，得到稀释10^-1的菌悬液；

另取装有4.5ml无菌水的试管6支，用记号笔边上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

从10^-1中取出0.5ml液体加入到10^-2中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10^-2菌液稀释液；同法由10^-2的试管中吸取0.5ml稀释液加入编号为10^-3的无菌水试管中，混匀后即为10^-3菌液稀释液，依次连续稀释至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀释液；

抑菌率测定过程以实验组操作为例：

取3个已倒完培养基的平板进行平行实验，避免出现实验的偶然性，减小实验误差；在3个培养基中分别打入实验组10^-7菌液稀释液200μl，用涂布棒涂抹均匀；涂布完毕后稍稍静置，以免菌液流动；静置完毕后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于温度为37℃的培养箱中，培养24小时后，观察实验结果；

电镜实验操作：

菌液的准备是将菌悬液和样品一起放入液体培养基中，菌种是大肠杆菌，恒温振荡培养12h，37℃；菌液预处理如下：

将菌液以3000r/min转速离心10min，弃上清液；

注入2.5％戊二醛，静置4h固定；

固定后离心，将细菌沉积，弃上清，以磷酸缓冲液pbs以1/15mol/l，ph＝7.2；配方：a2hpo4*12hpo4取23.876g+kh2po4取9.078g,分别溶于1l水中，然后将二者按照7:3的体积比混合,就可以了；重悬浮，重复3次，最后以pbs重悬。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种贺兰山紫蘑菇中提取的大黄素甲醚抗菌和抗氧化实验方法，本发明采用牛津杯法确定其抗菌性，用二倍稀释法得到最小抑菌浓度，用梯度稀释法计算其抑菌率；通过dpph法、羟自由基和超氧阴离子自由基清除法以标准vc作为阳性对照检测大黄素甲醚的抗氧化性。得到大黄素甲醚有明显的抗菌性，且大肠杆菌的抑菌率能达到75.78％；在三种自由基清除法中，大黄素甲醚对自由基清除率随浓度的升高而升高，但其抗氧化性都低于标准vc，为以后对贺兰山紫蘑菇的进一步研究开发打下基础。

附图说明

图1是本发明的实验流程图；

图2是本发明的大黄素甲醚对大肠杆菌的抑制结果图；

图3是本发明的大黄素甲醚对金葡的抑制结果图；

图4是本发明的大黄素甲醚对黑根霉的抑制结果图；

图5是本发明的大黄素甲醚对黑曲霉的抑制结果图；

图6是本发明的各浓度抑菌结果图；

图7是本发明的抑菌率对照组图；

图8是本发明的抑菌率实验组图；

图9是本发明的大黄素甲醚和抗坏血酸对dpph·的清除率图；

图10是本发明的大黄素甲醚和抗坏血酸对o2－·的清除率图；

图11是本发明的大黄素甲醚和抗坏血酸对·oh的清除率图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

本发明包括原料：分离自贺兰山紫蘑菇石油醚提取物的大黄素甲醚晶体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑根霉、黑曲霉；

试剂：二甲基亚砜、dpph、标准vc、硫酸亚铁、30％双氧水、水杨酸、盐酸、tris粉、邻苯三酚、无水乙醇；

主要实验仪器：ar224cn型电子天平、yxq-ls-100a型立式压力蒸汽灭菌器、vs-1300型洁净工作台、uv-1100型紫外可见分光光度计；s.c.101型鼓风电热恒温干燥箱、dk-s24型电热恒温水浴锅；

实验步骤：

(1)配制溶液：用二倍稀释法将大黄素甲醚和标准vc浓度配制为512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml进行抗菌和抗氧化实验；

(2)用牛津杯法进行定性实验；用二倍稀释法进行最小抑菌浓度测定；用梯度稀释法计算抑菌率；

(3)抗氧化检测所需溶液配制：

1)dpph·的清除实验：用无水乙醇配制浓度为0.08mmol/l的dpph溶液，避光保存，备用；

2)超氧阴离子自由基(o2－·)的清除实验：配制浓度为0.05mmol/ml的tris-hcl缓冲液，0.025mmol/ml的邻苯三酚溶液，8mol/l的hcl溶液，备用；

3)羟自由基(·oh)的清除实验：配制浓度为0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液，0.009mmol/ml的水杨酸-乙醇溶液，0.03％的h2o2溶液，备用；

抗氧化检测：

样品制备：将大黄素甲醚晶体溶于dmso溶剂中，并于30℃水浴锅中保温使其完全溶解，用二倍稀释法将样品配成有浓度梯度的待检测样品溶液编号备用，同样将抗坏血酸配成相同浓度梯度的待检测溶液编号备用；

抗氧化实验：

表1dpph·清除实验溶液添加情况表

其中，ai＝2.0mldpph·溶液+2.0ml样品液的吸光度，代表实验组；

aj＝2.0ml的样品液+2.0ml无水乙醇的吸光度，代表样品的本底颜色组(样品本身显黄色)；

ao＝2.0ml的dpph·溶液+2.0ml的无水乙醇的吸光度，代表空白对照组。

样品对dpph·的清除实验：分别取2.0ml各个浓度梯度的待测样品液到试管中，再加入2.0ml浓度为0.08mmol/l的新配制的dpph·溶液，然后混合均匀，使其反应30min后，在波长为517nm处用分光光度计检测其吸光度ai，同时测定样品本底颜色的吸光度aj以及不加样品液的空白对照的吸光度ao，并以下式计算其清除率：

dpph·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

样品对超氧阴离子自由基(o2－·)的清除实验：

表2超氧阴离子自由基(o2－·)的清除实验溶液添加情况表

其中，ai代表实验组；

aj代表样品的本底颜色组(样品本身显黄色)；

ao代表空白对照组。

用移液管精确取4.5mltris-hcl缓冲溶液，然后放入25℃水浴锅中预热20分钟，然后分别加入l.0ml各个浓度梯度的待测样品液和0.4ml浓度为0.025mmol/ml邻苯三酚溶液混合均匀，然后放入25℃水浴锅中反应5min，再加入1ml的8mol/lhcl溶液来终止反应，最后将溶液稀释10倍后在波长299mn处用分光光度计测定吸光度ai，以蒸馏水代替样品液作为空白对照，测定吸光度ao，同时用不加邻苯三酚溶液测得的吸光度aj代表样品的本底颜色，按下式计算清除率：

o2－·清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

样品对羟自由基(·oh)的清除实验：

表6羟自由基(·oh)的清除实验溶液添加情况表

其中，ai代表实验组；

aj代表样品的本底颜色组(样品本身显黄色)；

ao代表空白对照组。

分别加入1.0ml各个浓度梯度的待测样品溶液于试管中，加入1.0ml浓度为0.009mmol/ml的feso4·7h2o溶液和1.0ml0.03％h2o2溶液混匀，水浴锅中37℃孵育10min，再加入1.0ml浓度为0.009mmol/ml的水杨酸-乙醇溶液，混匀后37℃水浴锅中孵育30min，最后将溶液稀释10倍后在波长510nm处用分光光度计测定样品液的吸光度ai，以蒸馏水代替样品液作为空白对照，测定吸光度ao，用不加显色剂h2o2溶液测得的吸光度aj代表样品的本底颜色，计算方法如下式：

·oh清除率(％)＝(ao-(ai-aj))/ao×100％

抗菌实验：

实验材料

实验原材料

大黄素甲醚(自贺兰山紫蘑菇石油醚提取物中分离提纯得到)

大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)

金黄色葡萄球菌(staphyloccocusaureus，s.aureus)

黑根霉(rhizopusnigricans)

黑曲霉(aspergullusniger,a.niger)

有机溶剂

二甲基亚砜(dmso)、70％乙醇(由无水乙醇和蒸馏水配制)

其他药品：

牛肉膏蛋白胨固体培养基：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，ph7.4-7.6。

pda固体培养基：

新鲜土豆20g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，自然ph。

对紫蘑菇的石油醚提取物中得到的疑似大黄素甲醚的物质分别进行核磁共振实验、用扫描电镜观察，确定为大黄素甲醚，用dmso将大黄素甲醚溶解，采用牛津杯法进行抗菌的定性实验，针对大肠杆菌测定最小抑菌浓度，并测定抑菌率，在电镜下观察处理后的细胞形态，分析其抗菌机理；如图1所示为实验流程图。

培养基的配置及分装：

①称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中；

②溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，用玻棒搅匀，加热溶解；

③在加琼脂后调ph值，用1mol/l的naoh或1mol/l的hcl调ph，用ph试纸对照；

④加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水；

⑤分装：在漏斗架上分装，根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的1/5特别注意不要使培养基粘污在管口上以免浸湿棉塞，引起污染；

⑥包扎成捆、挂上标签；培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签；

⑦灭菌备用；灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面；培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24h，如确无菌生长、方可使用；

二种培养基的配方及具体配制方法

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基是一种天然培养基，用于培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌；其中，牛肉膏提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，nacl提供无机盐；

以配置1000ml牛肉膏蛋白胨培养基为例；

准确称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，加入到盛有1000ml蒸馏水的锅中，充分搅拌使其溶解；再称取琼脂15.0-20.0g，剪成小段，加入到锅中，不断搅拌以防糊锅；琼脂充分溶解后，调节ph至7.4至7.6；用精密ph试纸测量，当ph偏小时，缓慢滴加浓度为1mol/l的氢氧化钠调节，而当ph偏大的时候，则滴加浓度为1mol/l的盐酸调节来ph；最后加水至1000ml定容；将配好的培养基分装，加塞包扎牢固，等待灭菌；

pda培养基：pda培养基的全程为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即potatodextroseagar(medium)；pda培养基属于半合成培养基；

以配置1000mlpda固体培养基为例；

新鲜土豆洗净后去皮，称取200.0g土豆，切成小块状，加入到盛有1000ml蒸馏水的锅中，煮30分钟左右，直至能用玻璃棒头部戳进土豆内，接下来用三层纱布过滤得到土豆汁，持续加热，加入15.0g-20.0g琼脂和葡萄糖20.0g；琼脂条应剪成小段以加速溶解；持续加热、不断搅拌，防止琼脂糊锅；煮的过程中应该持续关注锅内沸腾额状况，防止锅内液体溢出；

分装要求：

将配置好的培养基用皮管和漏斗分装到试管或者到锥形瓶中；分装时，培养基的液面不能超过试管高度的五分之一，灭菌后摆成平面；分装到锥形瓶中时，培养基的液面应该在锥形瓶高度的三分之一左右；

在分装过程中，应该要注意避免培养基沾在试管口或锥形瓶口，以免引起污染；给试管和锥形瓶塞上棉塞，包好牛皮纸，用棉绳捆好扎牢，以防止被外界微生物污染；在分装好的试管和锥形瓶外面要贴好标签，写清培养基的种类，配置日期等，以便识别；

灭菌：

在实验室的操作中，灭菌一般分为干热灭菌和湿热灭菌；干热灭菌法的灭菌温度为160℃，灭菌时间为4小时；干热灭菌法适用于耐高温的玻璃和金属制品；湿热灭菌法的灭菌条件为，温度为121℃时利用高压蒸汽灭菌锅灭菌20分钟；由于水蒸气的穿透性相对比较强，培养基的灭菌经常采用湿热灭菌法；

移液枪头、无菌水和准备好的培养基用报纸包好后，采用湿热灭菌法，以121℃，20min高压蒸汽灭菌，将牛津杯、培养皿用报纸包好后，采用干热灭菌法以160℃，4h干热空气灭菌；将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上摆放斜面；灭菌后的培养基放入37℃的温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底，灭菌彻底的培养基放于低温处备用；除培养基外湿热灭菌后的东西都要置于烘箱内干燥，防治潮湿导致微生物滋生；

菌种活化：使用无菌操作台前先要在无菌操作台打开紫外灯杀菌30min，杀菌时一般将除菌种外实验中会使用到的实验材料如牛津杯、移液枪、培养皿、接种环等放在无菌操作台上一起灭菌，用pda培养基斜面活化黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培养基活化大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；黑曲霉28℃光照培养2天、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37℃培养24h备用；霉菌操作完成必须严格杀菌后才能进行大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的操作；

以活化大肠杆菌为例；

第一步：取无菌培养基两副，在培养皿底部做好标记；取已经融化好的牛肉膏蛋白胨培养基倒入无菌培养皿中，制成平板；

第二步：带平板冷却凝固后，用接种环取大肠杆菌一环，进行活化；

菌种活化方法有二种：

连续划线法：将挑取有大肠杆菌的接种环在平板培养基表面作连续划法，勿划破培养基；划线完毕后，倒置于37℃培养箱培养；

平板涂布法：挑去适量大肠杆菌于无菌水中，轻轻震荡混匀，制成菌悬液；用移液枪吸取100μl于培养基，用涂布棒涂抹均匀；

抑菌定性试验操作：

取一定量的大黄素甲醚晶体溶解于二甲基亚砜，放置于超声仪中超声10分钟以加速溶解，配置成浓度为256ug/ml的大黄素甲醚溶液；

将制好的培养基融化，无菌操作台开紫外灯杀菌后，在无菌操作台上到平板，待培养基凝固后用活化后的黑根霉、黑曲霉；用牛肉膏培养基活化大肠杆菌、金黄色葡萄球菌制成菌悬液，然后用移液枪将菌悬液移取100ul到培养基上，用涂布棒涂布均匀；在涂布好的平板上，放上已经灭菌的牛津杯--每个培养皿放置2个，样品溶液一个，另一个放dmso做空白对照，在牛津杯内用移液枪移取200ul的实验材料溶液，然后在对照组内注入200ul的dmso，将完成的黑根霉、黑曲霉培养皿小心移入培养箱培养48h，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的培养皿移至37℃培养箱，培养24h，观察实验结果；

最小抑菌浓度测定的操作：

准备4个洁净干燥的25ml容量瓶，采用二倍稀释法配置得到系列浓度梯度的大黄素甲醚溶液；

4个容量瓶依次做好标记：256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，分别记为容量瓶1、容量瓶2、容量瓶3、容量瓶4；从容量瓶1中取出12.5ml浓度为256μg/ml大黄素甲醚溶液，加入到容量瓶2中，用dmso定容，混合均匀，得到浓度为128μg/ml的大黄素甲醚溶液；照此方法，依次得到浓度为64μg/ml、32μg/ml的大黄素甲醚溶液；

以浓度为256μg/ml的大黄素甲醚为实验对象为例；

取3个已倒完培养基的平板进行平行实验，避免出现实验的偶然性，减小实验误差；在3个培养基中分别打入大黄素甲醚溶液200μl，加入少量菌液，用涂布棒涂抹均匀；涂布完毕后稍稍静置，以免菌液流动；静置完毕后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于温度为37℃的培养箱中，培养24小时后，观察实验结果；

照此方法，对浓度为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml的大黄素甲醚溶液也分别进行实验；

抑菌率测定的操作：

以大肠杆菌为实验菌种，实验样品为浓度为上一步骤中得到的最小抑菌浓度；

准备14支已灭菌的试管备用，分为实验组和对照组；

用活化好的大肠杆菌制作菌悬液

实验组：

取大黄素甲醚溶液0.5ml，菌液0.5ml，加入到装有4.0ml无菌水的试管中，震荡，得到稀释10^-1的菌悬液；

另取装有4.5ml无菌水的试管6支，用记号笔边上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

从10^-1中取出0.5ml液体加入到10^-2中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10^-2菌液稀释液；同法由10^-2的试管中吸取0.5ml稀释液加入编号为10^-3的无菌水试管中，混匀后即为10^-3菌液稀释液，依次连续稀释至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀释液；

对照组：

取菌液0.5ml，加入到装有4.5ml无菌水的试管中，震荡，得到稀释10^-1的菌悬液；

另取装有4.5ml无菌水的试管6支，用记号笔边上10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；

从10^-1中取出0.5ml液体加入到10^-2中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10^-2菌液稀释液；同法由10^-2的试管中吸取0.5ml稀释液加入编号为10^-3的无菌水试管中，混匀后即为10^-3菌液稀释液，依次连续稀释至10^-4、10^-5、10^-6、10^-7菌液稀释液；

抑菌率测定过程以实验组操作为例：

取3个已倒完培养基的平板进行平行实验，避免出现实验的偶然性，减小实验误差；在3个培养基中分别打入实验组10^-7菌液稀释液200μl，用涂布棒涂抹均匀；涂布完毕后稍稍静置，以免菌液流动；静置完毕后用封口膜封住以免被染菌，倒置放于温度为37℃的培养箱中，培养24小时后，观察实验结果；

电镜实验操作：

菌液的准备是将菌悬液和样品一起放入液体培养基中，菌种是大肠杆菌，恒温振荡培养12h，37℃；菌液预处理如下：

将菌液以3000r/min转速离心10min，弃上清液；

注入2.5％戊二醛，静置4h固定；

固定后离心，将细菌沉积，弃上清，以磷酸缓冲液pbs以1/15mol/l，ph＝7.2；配方：a2hpo4*12hpo4取23.876g+kh2po4取9.078g,分别溶于1l水中，然后将二者按照7:3的体积比混合,就可以了；重悬浮，重复3次，最后以pbs重悬。

结果与分析：

抗菌性结果：

大黄素甲醚对两种细菌的抑制作用

图1中抑菌圈直径(对照组：1.30cm实验组：2.30cm)；图2中抑菌圈直径(对照组：1.20cm实验组：1.80cm)

通过图2和图3可以看出，大黄素甲醚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都有良好的抗菌性能，且对大肠杆菌的抗菌活性较金葡有更强的抗菌活性。

大黄素甲醚对两种真菌的抑制作用

图3中抑菌圈直径(对照组:0.80cm实验组:1.80cm)，图4中抑菌圈直径(对照组:0.80cm实验组:2.00cm)

通过图3和图4可以看出，大黄素甲醚对黑根霉、黑曲霉都有良好的抗菌性能。

如图6、图7和图8所示：大黄素甲醚对大肠杆菌的最小抑菌浓度

在本阶段实验中，发现浓度为256μg/ml的样品有相对较为明显的抑菌效果。所以在下阶段的抑菌率测定中以浓度为256μg/ml的样品作为实验对象。

大黄素甲醚最小抑菌浓度的抑菌率

表4大黄素甲醚最小抑菌浓度的菌落数和抑菌率

抑菌率(％)＝(对照组-实验组)/对照组*100％

抗氧化性结果：

大黄素甲醚对dpph·的清除率

表5不同浓度的大黄素甲醚溶液对dpph·的清除率

表6大黄素甲醚与标准vc对dpph·的清除率

图9为大黄素甲醚和抗坏血酸对dpph·的清除率

大黄素甲醚对超氧阴离子自由基的清除率：

表7不同浓度的大黄素甲醚溶液对o2－·的清除率

表8大黄素甲醚与抗坏血酸对o2－·的清除率

图10为大黄素甲醚和抗坏血酸对o2－·的清除率

大黄素甲醚对羟自由基的清除率：

表9不同浓度的大黄素甲醚溶液对·oh的清除率

表10大黄素甲醚与抗坏血酸对·oh的清除率

图11为大黄素甲醚和抗坏血酸对·oh的清除率

结论：

抗菌性实验：大黄素甲醚的dmso溶液有抗菌活性，它的抑菌效果对大肠杆菌最为明显，并且在浓度为256μg/ml时表现出良好的抗菌性能，当实验菌种为大肠杆菌时，抑菌率能达到75.78％。抗氧化实验：(1)在dpph自由基清除法、羟基自由基清除法和超氧阴离子自由基清除法三种测定方法下，大黄素甲醚溶液溶度与自由基清除率成正相关，表现为大黄素甲醚对自由基清除率随样品浓度的升高而升高；(2)通过与抗坏血酸(标准vc)抗氧化效果相比较，结果显示在三种不同的方法下大黄素甲醚的抗氧化效果均低于抗坏血酸(标准vc)，也就是说大黄素甲醚具有一定的抗氧化作用。

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