草甘膦降解菌及其在处理重金属‑草甘膦复合污染中应用的制作方法

本发明属于微生物领域，尤其涉及一株具有重金属抗性的草甘膦降解菌胶红酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)及其在重金属污染环境下对草甘膦的降解。

背景技术：

草甘膦(n-膦酸甲基-甘氨酸)是一种内吸传导型广谱除草剂，因其高效、作用效果显著在农业上被广泛应用。但近年来的研究表明，长期施用草甘膦会对非靶标生物和环境造成不可估计的影响，尤其是对水生生物和土壤微生物等具有非常严重的毒害作用。此外，随着现代工农业的发展，进入环境中的重金属日益增多，污水灌溉、含重金属农药和化肥施用等的频繁使用，更加恶化了环境。这些生产方式可能导致重金属-草甘膦的复合污染，对生态系统的结构和功能产生影响。

农药残留的传统处理方法主要采取化学法或焚烧、掩埋的方法。这些方法的缺点很明显，即副作用大、易造成二次污染、成本较高、作用慢等。生物修复主要是利用微生物及其产品来降解污染物，它具有无毒、无残留、成本较低等优点。到目前为止，大多数报道草甘膦降解菌对有毒重金属元素并不具有很好的抗性，不能在重金属存在的环境中对草甘膦进行有效降解，限制了微生物修复技术的实际应用范围。重金属-草甘膦复合污染形式非常普遍地存在于环境中，微生物降解法的关键是筛选并分离出高效、安全、环境适应性强的草甘膦降解菌株。因此，筛选具有重金属抗性的高效草甘膦降解菌，利用这些菌株具有利用草甘膦作为碳源和氮源的能力，以及对重金属具有抗性的能力，可在快速将草甘膦分解同化的同时吸附重金属，达到降解环境中草甘膦的目的。

技术实现要素：

针对现有技术无法有效处理重金属-草甘膦复合污染的上述问题，本发明旨在提供一种具有重金属抗性的高效降解草甘膦废水的胶红酵母菌，利用这种胶红酵母降解水体中草甘膦污染物的方法，解决重金属污染环境下草甘膦的微生物降解问题。该方法利用可以在较高浓度重金属条件下生长的胶红酵母降解水中的草甘膦，是一种操作简单、成本低廉的降解水体中草甘膦的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株胶红酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)op11，其保藏编号为cgmccno.13540。

上述胶红酵母菌在处理重金属-草甘膦复合污染中的应用。

一种重金属-草甘膦废水的处理方法，将权利要求1所述的胶红酵母菌悬浮于含重金属-草甘膦复合污染物的废水中培养。

上述技术方案，进一步地，所述草甘膦的浓度为500mm。

上述技术方案，进一步地，所述重金属为铜、镉、镍或铬，所述铜的浓度为250mg/kg，镉的浓度为5mg/kg，镍的浓度为100mg/kg，铬的浓度为250mg/kg。

上述技术方案，进一步地，所述胶红酵母菌的接种量为2-5％。

上述技术方案，进一步地，所述废水的ph范围为4.0-9.0。

上述技术方案，进一步地，所述培养的ph范围为5.0-7.0。

上述技术方案，进一步地，所述培养的温度为28-35℃。

上述技术方案，进一步地，所述培养时间60-90h。

本发明分离筛选的胶红酵母菌具有以下优势：

1.本发明的胶红酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)op11能够降解草甘膦以其作为唯一碳源生长，培养60h左右达到最大od值。菌株抗草甘膦浓度在500mmol/l以上。在草甘膦浓度为100和250mm的基础盐培养基中，培养60h后菌株op11对草甘膦的降解率达到最大，分别为81.9％和79.3％。在草甘膦浓度为500mm时，菌株op11在培养72h时对草甘膦的降解率达到最大，为53.1％。

2.本发明的菌株op11在以草甘膦为唯一碳源的培养基中生长的ph范围较宽，在ph4.0到ph9.0之间范围内生长良好，对草甘膦均有较好的降解作用。菌株op11在ph6.0草甘膦的降解率达到最大值，为83.5％。

3.本发明的菌株op11在重金属cu2+浓度为0-250mg/kg范围内，均能保持对草甘膦均有较好的降解作用。在重金属cu2+浓度为0、5、50、100和250mg/kg时，培养60h后，菌株op11对草甘膦的降解率分别为：80.1％、79.7％、72.6％、67.9％和53.1％。

4.本发明的菌株op11在重金属cd2+浓度为0-5mg/kg范围内，均能保持对草甘膦均有较好的降解作用。在重金属cd2+浓度为0、0.25、1、2.5和5mg/kg时，培养60h后，菌株op11对草甘膦的降解率分别为：80.2％、82.6％、70.6％、61.5％和45.8％。

5.本发明的菌株op11在重金属ni2+浓度为0-100mg/kg范围内，均能保持对草甘膦均有较好的降解作用。在重金属cd2+浓度为0、2.5、10、50和100mg/kg时，培养60h后，菌株op11对草甘膦的降解率分别为：81.3％、81.6％、79.6％、60.5％和52.8％。

6.本发明的菌株op11在重金属cr6+浓度为0-500mg/kg范围内，均能保持对草甘膦均有较好的降解作用。在重金属cd2+浓度为0、5、50、100和250mg/kg时，培养60h后，菌株op11对草甘膦的降解率分别为：79.6％、81.2％、76.9％、61.6％和47.8％。

附图说明

图1为本发明胶红酵母op11平板图；

图2为本发明胶红酵母op11镜检图；

图3为菌株its区域的pcr扩增产物电泳图(从上到下依次是1000bp、750bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；

图4为菌株op11对草甘膦浓度的耐受性；

图5为菌株op11对不同浓度草甘膦的降解；

图6为ph对菌株op11降解草甘膦的影响。

生物材料样品保藏信息：

胶红酵母(rhodotorulamucilaginosa)op11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年1月6日，保藏编号为cgmccno.13540。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

以下实施例用的材料如下：

富集培养基(g/l)：葡萄糖50g，酵母膏0.5g，(nh4)2s1g，kh2po42.5g，na2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.02g。

无机盐培养基(g/l)：mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，k2hpo41.31g，nano33.0g，feso4·7h2o0.02g。

麦芽汁培养基(g/l)：麦芽汁20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，ph自然。固体培养基加入2.0％的琼脂。

重金属cu²⁺、cd²⁺、ni²⁺、cr⁶⁺溶液：所用药品分别为cucl2·2h2o、cdcl2·2.5h2o、nicl2·6h2o、cr2k2o7，天津市申泰化学试剂有限公司生产，分析纯，纯度≧99％。

实施例1胶红酵母op11的筛选

(一)菌株的分离及纯化

1、菌株的富集：采集长期施用草甘膦的农田土壤样品2.5g，置于含有60ml富集培养基的摇瓶中，加入由无菌水配置的100mm草甘膦30ml和5mmcucl2溶液10ml，置于摇床中，30℃，180rpm，恒温振荡培养4d。

2、菌株的驯化：在无菌条件下按10％的接种量将菌液加入以草甘膦为唯一碳源的无机盐基础液体培养基中，草甘膦和cu2+的浓度分别由100mm、250mm增加到500mm，由5mm、10mm增加到15mm。培养液总体积为100ml，置于摇床中，30℃，180rpm，恒温振荡培养，4d为一个驯化周期，进行三个周期的驯化。

3、菌株的纯化：

经过三个周期的驯化，无菌条件下取100μl培养液在含有草甘膦作为唯一碳源的无机盐平板上涂布，30℃恒温培养，挑取单菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落，如图1所示。将得到的菌株接种于麦芽汁培养基平板上，4℃保存。

(二)菌株的鉴定

1、形态特征与基本生理生化特性

菌株op11在固体培养基上菌落形态如图1所示，菌落呈橙红色，圆形凸起，边缘整齐，质地粘稠，有光泽。细胞为椭圆形或卵形，单一、成对、短链排列或形成小丛集，如图2所示。。菌株op11能以多种碳源生长，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、d-木糖等，对乙醇和渗透压有一定的耐受性，其碳、氮源同化试验结果见表1。

表1菌株胶红酵母op11的碳、氮源同化

注：+：阳性反应；－：阴性反应；v：可变反应。

2、分子遗传学分类鉴定

提取到该菌株的dna后进行真菌18srdnaits序列pcr扩增，图3为菌株its区域的pcr扩增产物电泳图(从上到下依次是1000bp、750bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，将测序结果在ncbi上进行blast比对分析，发现其与胶红酵母(rhodotorulamucilaginosah8-4，登录号为kt976599.1)的dna序列同源性为100％。结合传统的形态特征和生理生化鉴定结果，鉴定菌株为胶红酵母(rhodotorulamucilaginosa)。胶红酵母op11的its区域基因序列如sequencelisting所示。

实施例2菌株op11对草甘膦的耐受性及降解性

无菌条件下，将纯化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基础盐培养基中预培养24h(od≈1.0)，培养液按照体积分数为5％的接种量接种至基础盐培养基中，分别添加不同浓度(100、250和500mm)的草甘膦作为碳源，30℃，180rpm，振荡培养4d。每隔6h取样测定菌体生长量和对草甘膦的降解率。使用紫外分光光度计测定菌体在波长600mn处的od值，绘制生长曲线。采用亚硝基化紫外分光光度法测定上清液中草甘膦的浓度。

降解率的计算方法：降解率(％)＝(1-c1/c0)×100。c1：降解菌处理草甘膦残留浓度，c0：对照处理草甘膦残留浓度。

由图4可以看出，在草甘膦浓度为100、250和500mm的基础盐培养基中，菌株op11能够降解草甘膦并以其为唯一碳源生长，第2d有肉眼可见生长。在草甘膦浓度为100和250mm的基础盐培养基中，菌株op11培养48h达到最大od值，同时细胞在草甘膦浓度为250mm时生长最快。在草甘膦浓度为500mm时，菌株op11生长相对较慢，培养54h达到最大od值。综合观察结果，菌株op11对草甘膦的抗性在500mm以上。

由图5可以看出，在草甘膦浓度为100、250和500mm的基础盐培养基中，随着培养时间的增加，菌株op11对草甘膦的降解率均表现出逐渐增加的趋势。在草甘膦浓度为100和250mm的基础盐培养基中，培养60h后菌株op11对草甘膦的降解率达到最大，分别为81.9％和79.3％，之后降解率趋于稳定。在草甘膦浓度为500mm时，菌株op11在培养72h时对草甘膦的降解率达到最大，为53.1％。

实施例3不同ph下菌株op11对草甘膦的降解

无菌条件下，将纯化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基础盐培养基中预培养24h(od≈1.0)，培养液按照体积分数为5％的接种量接种至ph分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0以250mm草甘膦为唯一碳源的无机盐培养基中，30℃，180rpm，恒温振荡培养60h后测定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的测定同实施案例2。

由图6可以看出，菌株op11在以草甘膦为唯一碳源的培养基中生长的ph范围较宽，在ph4.0到ph9.0之间范围内生长良好，对草甘膦均有较好的降解作用。菌株op11对草甘膦降解的最适ph范围为ph5.0-7.0，在ph6.0草甘膦的降解率达到最大值，为83.5％。

实施例4含铜溶液中菌株op11对草甘膦的降解

无菌条件下，将纯化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基础盐培养基中预培养24h(od≈1.0)，培养液按照体积分数为5％的接种量分别接种至含0、5、50、100和250mg/kgcu²⁺的以250mm草甘膦为唯一碳源的无机盐培养基中，30℃，180rpm，恒温振荡培养60h后测定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的测定同实施案例2。60h后，菌株op11对含0、5、50、100和250mg/kgcu²⁺的草甘膦溶液降解率分别为：80.1％、79.7％、72.6％、67.9％和53.1％。

实施例5含镉溶液中菌株op11对草甘膦的降解

无菌条件下，将纯化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基础盐培养基中预培养24h(od≈1.0)，培养液按照体积分数为5％的接种量分别接种至含0、0.25、1、2.5和5mg/kgcd²⁺的以250mm草甘膦为唯一碳源的无机盐培养基中，30℃，180rpm，恒温振荡培养60h后测定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的测定同实施案例2。60h后，菌株op11对含0、0.25、1、2.5和5mg/kgcd²⁺的草甘膦溶液降解率分别为：80.2％、82.6％、70.6％、61.5％和45.8％。

实施例6含镍溶液中菌株op11对草甘膦的降解

无菌条件下，将纯化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基础盐培养基中预培养24h(od≈1.0)，培养液按照体积分数为5％的接种量分别接种至含0、2.5、10、50和100mg/kgni²⁺的以250mm草甘膦为唯一碳源的无机盐培养基中，30℃，180rpm，恒温振荡培养60h后测定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的测定同实施案例2。菌株op11对含0、2.5、10、50、和100mg/kgni²⁺的草甘膦溶液降解率分别为：81.3％、81.6％、79.6％、60.5％和52.8％。

实施例7含铬溶液中菌株op11对草甘膦的降解

无菌条件下，将纯化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基础盐培养基中预培养24h(od≈1.0)，培养液按照体积分数为5％的接种量分别接种至含0、5、50、100和250mg/kgcr⁶⁺的以250mm草甘膦为唯一碳源的无机盐培养基中，30℃，180rpm，恒温振荡培养60h后测定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的测定同实施案例2。菌株op11对含0、5、50、100、和250mg/kgcr⁶⁺的草甘膦溶液降解率分别为：79.6％、81.2％、76.9％、61.6％和47.8％。

上述实施例2-7表明本发明的菌株op11具有利用草甘膦作为碳、氮源的能力，以及对重金属具有抗性的能力，可在快速将草甘膦分解同化的同时吸附重金属，达到降解环境中草甘膦的目的。

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