微液滴式PCR芯片及其制造方法与流程

本发明涉及生物医学应用仪器领域，尤其涉及一种微液滴式pcr芯片，及所述微液滴式pcr芯片的制造方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，简称pcr)，作为分子生物学和基因工程的一项重要技术，其是一种在引物引导下选择性扩增dna和rna片段的方法，设有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。现阶段生物工程采用的pcr扩增仪可对所需要的目的基因片段进行连续多次扩增，并可以复制到几百万倍数量级的数目，广泛应用于以获得目的基因或基因片段为目的的生命科学，医学工程，遗传功臣，疾病诊断等许多领域。

微液滴技术在生物化学领域迅速发展。基于微液滴技术可以操控微小体积的液滴，并可以实现微液滴的稳定生成、表面处理、破裂、融合及多层液滴制备，因此微液滴可用于容器进行微生物培养、反应酶分析、微球颗粒的形成等。

微液滴式pcr芯片产出的微液滴粒径稳定、均一，并且可操控性强，能够较为方便快捷地与反应酶、反应物与催化剂等物质融合。微液滴式pcr芯片将pcr反应液与油相试剂混合以生成微液滴并储存在pcr反应区，后续微液滴将进行pcr反应。

但是，常规的微液滴式pcr芯片无法有效隔离pcr反应区的微液滴，在pcr反应过程中，微液滴容易脱离pcr反应区，导致pcr反应异常。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种微液滴式pcr芯片，及所述微液滴式pcr芯片的制造方法，能够在微液滴式pcr芯片中形成封闭阀门，防止微液滴容易脱离pcr反应区。

一种微液滴式pcr芯片，包括相贴合的盖片和基片；所述盖片朝向所述基片的表面设有油相试剂流道、pcr反应液流道、混合流道、pcr反应腔和排液流道；所述混合流道的相对两端分别设有混合入口和液滴出口；所述油相试剂流道和所述pcr反应液流道的一端均交汇于所述混合入口，所述油相试剂流道和所述pcr反应液流道的另一端分别设有油相试剂注入口和pcr反应液注入口，所述油相试剂流道的流道内径由所述油相试剂注入口到所述混合入口逐渐减小，所述pcr反应液流道的流道内径由所述pcr反应液注入口到所述混合入口逐渐减小；所述pcr反应腔的两侧各设有一个填充腔，一个所述填充腔连通所述pcr反应腔填充腔及所述液滴出口，另一个填充腔连通所述pcr反应腔填充腔与所述排液流道；每个所述填充腔中填充有热膨胀颗粒。

其中，所述油相试剂流道在所述油相试剂注入口处分为第一分流道和第二分流道，所述第一分流道与所述第二分流道汇聚于所述混合入口。

其中，所述油相试剂流道与所述pcr反应液流道的内壁上均设有用于过滤杂质的凸起。

一种微液滴式pcr芯片的制造方法，用于制造权利要求1-3中任一项所述的微液滴式pcr芯片，包括：提供基片和衬底，并制备具有第一图案的第一掩膜板和具有第二图案的第二掩膜板；使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通过光刻工艺在所述衬底上形成并排拼接的第一阳模和第二阳模，其中，所述第一阳模上与所述第一图案对应的区域形成有所述油相试剂流道的图形、所述pcr反应液流道的图形，以及所述混合流道的图形，所述第二阳模上与所述第二图案对应的区域形成有两个所述填充腔的图形、所述pcr反应腔的图形，以及所述排液流道的图形；以所述第一阳模和所述第二阳模为模板形成盖片基体，所述盖片基体的表面设有未开设所述pcr反应液注入口的pcr反应液流道、未开设有所述油相试剂注入口的所述油相试剂流道、所述混合流道、所述pcr反应腔、所述排液流道，及两个所述填充腔；在两个所述填充腔内填充热膨胀颗粒，并在所述盖片基体的表面加工出所述油相试剂注入口、所述pcr反应液注入口及所述排液流道的排液口，形成包含所述油相试剂流道、所述pcr反应液流道、所述排液流道、所述混合流道、所述pcr反应腔，及两个所述填充腔的所述盖片；对所述盖片与所述基片进行清洗，之后将所述盖片与所述基片对准贴合，得到所述微液滴式pcr芯片。

其中，所述使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通过光刻工艺在所述衬底上形成并排拼接的第一阳模和第二阳模包括：在所述衬底上涂覆第一光刻胶层并进行烘烤；通过曝光将所述第一掩膜板上的所述第一图案转印到所述第一光刻胶层上，以在所述第一光刻胶层上形成与所述第一图案对应的所述油相试剂流道的图形、所述pcr反应液流道的图形，以及所述混合流道的图形，之后除去所述第一掩膜板；在所述衬底上涂覆第二光刻胶层并进行烘烤，所述第二光刻胶层与所述第一光刻胶层并排拼接；通过曝光将所述第二掩膜板上的所述第二图案转印到所述第二光刻胶层上，以在所述第二光刻胶层上形成与所述第二图案对应的所述pcr反应腔的图形、所述排液流道的图形，以及两个所述填充腔的图形，之后除去所述第二掩膜板；去除未固化的光刻胶并做坚膜处理，得到所述第一阳模和所述第二阳模。

其中，所述以所述第一阳模和所述第二阳模为模板形成盖片基体包括：在所述第一阳模和所述第二阳模上浇注模型胶，经脱气泡、固化后揭膜，得到所述盖片基体。

其中，在步骤使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通过光刻工艺在所述衬底上形成并排拼接的第一阳模和第一阳模，与步骤以所述第一阳模和所述第二阳模为模板形成盖片基体之间，还包括：使用脱模剂处理所述第一阳模和所述第二阳模的步骤。

其中，所述热膨胀颗粒占据所述填充腔的容积的30％。

其中，所述脱模剂为三氯甲基硅氧烷。

其中，所述模型胶包括聚二甲基硅氧烷。

由此，本发明的微液滴式pcr芯片，通过在pcr反应腔的两侧分别设置填充热膨胀颗粒的填充腔，使用填充热膨胀颗粒的填充腔作为封闭阀门，将pcr反应腔完全隔离，避免了微液滴脱离pcr反应腔，保证了pcr反应腔内的pcr反应正常进行。本发明的微液滴式pcr芯片的制造方法，使用光刻工艺能够方便快捷地成型具有微通道结构的盖片，且成本低廉；通过使用两个掩膜板分别进行光刻，便于形成不同厚度的光刻胶图案层、最终成型盖片的不同厚度区域；通过形成两个填充腔，并在两个填充腔中填充热膨胀颗粒，能够使得微液滴式pcr芯片具有封闭阀门。

附图说明

为更清楚地阐述本发明的构造特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。

图1是本发明实施例的盖片的截面结构示意图；

图2是图1中i处的局部放大结构示意图；

图3是本发明实施例的微液滴式pcr芯片的制造方法的流程框图；

图4是图3中的s220步骤的具体流程框图；

图5是本发明实施例的微液滴式pcr芯片的制造方法的又一个流程框图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种微液滴式pcr芯片，用于生成pcr微液滴和进行pcr反应。

如图1所示，微液滴式pcr芯片包括盖片10。微液滴式pcr芯片还包括基片(图未示)，基片与盖片10相贴合，封装成完整的芯片。基片的材料包括但不限于玻璃，盖片10的材料包括但不限于为聚二甲基硅氧烷(pdms)，基片与盖片10的贴合形式包括但不限于采用真空氧等离子体进行键合封装。

如图1所示，盖片10朝向基片的表面设有油相试剂流道11、pcr反应液流道12、混合流道13、pcr反应腔15和排液流道17。其中，油相试剂流道11是油相试剂的流动通道。pcr反应液流道12是pcr反应液的流动通道，pcr反应液包括但不限于为dna(脱氧核糖核酸)目标片段、dna引物、pcr反应酶和底物的混合液。油相试剂与pcr反应液分别流入混合流道13，在混合流道13内进行混合并形成微液滴。微液滴又流入pcr反应腔15，在pcr反应腔15内进行pcr反应。经过pcr反应之后，多余的油相试剂从排液流道17排出。微液滴形成及pcr反应的详细过程，下文将继续描述。

如图1所示，混合流道13的相对两端分别设有混合入口131和液滴出口132，油相试剂流道11和pcr反应液流道12的一端均交汇于混合入口131，油相试剂流道11和pcr反应液流道12的另一端分别设有油相试剂注入口113和pcr反应液注入口121。并且，如图2所示，油相试剂流道11的流道内径由油相试剂注入口113到混合入口131逐渐减小，pcr反应液流道12的流道内径由pcr反应液注入口121到混合入口131逐渐减小。油相试剂流道11及pcr反应液流道12的最狭窄处可以是50um。pcr反应腔15的两侧各设有一个与pcr反应腔15连通的填充腔14和16，填充腔14与液滴出口132连通，填充腔16与排液流道17连通。在图1所示视角下，填充腔16位于pcr反应腔15的底部，便于多余油相试剂快速排出pcr反应腔15。排液流道17远离填充腔16的一端设有排液口171。

本实施例的微液滴式pcr芯片中，各个流道及流道口的形状并不限于为图1中所示。例如，油相试剂流道11、pcr反应液流道12、混合流道13、填充腔14、pcr反应腔15、填充腔16和排液流道17的截面不限于为矩形，可以根据实际需要设计成其他图形；油相试剂流道11、混合流道13和排液流道17不限于为呈90°折弯，也可以是直线或光滑弯曲的曲线；油相试剂注入口113、pcr反应液注入口121和排液口171的截面不限于为圆形，可以根据实际需要设计成其他图形。

填充腔14和16中均填充有热膨胀颗粒。热膨胀颗粒在加热状态下能够迅速膨胀。例如，使用波长为532nm的强射激光器定点照射填充腔14和16中的热膨胀颗粒，在照射温度达到100℃时，只需1s的持续照射时间即可使热膨胀颗粒达到完全膨胀的状态。或者，在其他热源如热板、烘箱等加热容器的加热下，热膨胀颗粒同样可以膨胀。在达到稳定膨胀状态后，热膨胀颗粒堵塞填充腔14和16，将pcr反应腔15隔绝，从而将pcr反应腔15内的微液滴封闭在内。即热膨胀颗粒起到封闭阀门的作用。

优选的，未膨胀状态下的热膨胀颗粒，占据填充腔14和16容积的30％，填充腔14和16中剩余的70％容积，是预留给热膨胀颗粒的膨胀空间。在其他实施例中，热膨胀颗粒的容积占比可以根据实际需要确定。

以下将结合本微液滴式pcr芯片的结构，详细描述本实施例中微液滴生成和pcr反应的过程，以突出本实施例方案的技术效果。以下所述仅为本发明的一个优选方案，本发明实际上并不限于此。

一、微液滴生成过程

按照图1视角中的竖直方向放置微液滴式pcr芯片，即将微液滴式pcr芯片立起来放置。在微液滴式pcr芯片内预先注入油相试剂。具体的，油相试剂从油相试剂注入口113进入油相试剂流道11，依次流经混合流道13和填充腔14，最终进入pcr反应腔15，并沉积在图1中所示的pcr反应腔15的底部。预先注入的油相试剂，是为后续的微液滴生成创造一个浸润的油相环境。

然后，在微液滴式pcr芯片内注入pcr反应液。具体的，pcr反应液从pcr反应液注入口121进入pcr反应液流道12，流经混合入口131，并在混合入口131处与油相试剂相遇。由于从油相试剂注入口113到混合入口131，油相试剂流道11的流道内径逐渐减小，从pcr反应液注入口121到混合入口131，pcr反应液流道12的流道内径也逐渐减小，在毛细作用下，混合入口131处的油相试剂液滴将对pcr反应液液滴进行“剪切”，使得pcr反应液液滴包裹上一层油相试剂。油相试剂与pcr反应液的混合液经过混合通道13后，最终形成微环境独立的微液滴。

微液滴从液滴出口132流出，并流入填充腔14及pcr反应腔15。微液滴不断地生成和流入，逐渐集聚在pcr反应腔15内。由于微液滴式pcr芯片是立起来放置并且预先浸润有油相试剂的，油相试剂的比重又大于pcr反应液的比重，因此进入pcr反应腔15的微液滴将会自动漂浮在上层、油相试剂位于下层。下层的多余油相试剂将会流经填充腔16，从排液流道17的排液口171流出。

二、pcr反应过程

待微液滴生成完毕后，使用高强度激光照射微液滴式pcr芯片的填充腔14和16，使热膨胀颗粒完全膨胀，将填充腔14和16封闭。热膨胀颗粒完全膨胀所需的光照时间极短，例如最多需要500ms的光照时间。并且在完全膨胀后，热膨胀颗粒不需要继续吸热，也可以维持完全膨胀状态。在激光照射下，热膨胀颗粒更易发生膨胀，便于缩短pcr反应时间；并且激光设备成本低廉，能减小实验开支。在其他实施例中，也可以将微液滴式pcr芯片放置在热板或烘箱等加热容器内，激发热膨胀颗粒发生膨胀。

之后，将微液滴式pcr芯片置于pcr仪的加热板上，并设定pcr反应程序，进行pcr反应。在pcr反应中微液滴式pcr芯片内的温度会上升，导致pcr反应腔15内的微液滴发生跑动。但是由于有处于膨胀状态的热膨胀颗粒存在，微液滴无法脱离pcr反应腔15，从而能保证pcr反应的正常进行。在完成pcr反应之后，可以使用荧光显微镜观察并记录pcr结果。

因此，本实施例的微液滴式pcr芯片，通过在pcr反应腔15的两侧设置填充热膨胀颗粒的填充腔14和16，使用填充热膨胀颗粒的填充腔14和16作为封闭阀门，将pcr反应腔15完全隔离，保证了pcr反应腔15内的pcr反应正常进行。本热膨胀颗粒的热膨胀性能良好，便于操控，由此也提升了本微液滴式pcr芯片的pcr反应效率。

进一步的，如图1和图2所示，油相试剂流道11在油相试剂注入口113处分为第一分流道111和第二分流道112。第一分流道111和第二分流道112汇聚于混合入口131。设置第一分流道111和第二分流道112，能使油相试剂双向注入，加速了微液滴的生成，提升了pcr反应效率。在其他实施例中，油相试剂流道11也可以不分叉。

进一步的，如图2所示，油相试剂注入口113与pcr反应液注入口121处，分别设有过滤装置114和过滤装置122，用于对进入油相试剂流道111和pcr反应液流道12的试剂进行过滤，去除试剂中的杂质。过滤装置114和过滤装置122可以过滤一定颗粒直径阈值以上的杂质。例如，可以将大于50um的杂质过滤掉，以避免杂质颗粒堵塞油相试剂流道11及pcr反应液流道12的最狭窄区域。

进一步的，过滤装置114可以包括多个间隔设在油相试剂流道111与112的内壁上的凸起，过滤装置122可以包括多个间隔设在pcr反应液流道12的内壁上的凸起。多个凸起阵列分布，相邻凸起的间隔能阻挡颗粒直径阈值以上的杂质通过，从而起到过滤作用。在其他实施例中，过滤装置114和/或过滤装置122的结构形式可以不限于为本实施例所述，只要能起到过滤杂质的作用即可。

以上实施例详细描述了本发明的微液滴式pcr芯片的结构，以下实施例将详细描述本微液滴式pcr芯片的制造方法。

如图1所示，本实施例的微液滴式pcr芯片的制造方法200包括：

s210，提供基片和衬底，并制备具有第一图案的第一掩膜板和具有第二图案的第二掩膜板；

s220，使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通过光刻工艺在所述衬底上形成并排拼接的第一阳模和第二阳模，其中，所述第一阳模上与所述第一图案对应的区域形成有所述油相试剂流道的图形、所述pcr反应液流道的图形，以及所述混合流道的图形，所述第二阳模上与所述第二图案对应的区域形成有两个所述填充腔的图形、所述pcr反应腔的图形，以及所述排液流道的图形；

s240，以所述第一阳模和所述第二阳模为模板形成盖片基体，所述盖片基体的表面设有未开设所述pcr反应液注入口的pcr反应液流道、未开设有所述油相试剂注入口的所述油相试剂流道、所述混合流道、所述pcr反应腔、所述排液流道，及两个所述填充腔；

s250，在两个所述填充腔内填充热膨胀颗粒，并在所述盖片基体的表面加工出所述油相试剂注入口、所述pcr反应液注入口及所述排液流道的排液口，形成包含所述油相试剂流道、所述pcr反应液流道、所述排液流道、所述混合流道、所述pcr反应腔，及两个所述填充腔的所述盖片；

s260，对所述盖片与所述基片进行清洗，之后将所述盖片与所述基片对准贴合，得到所述微液滴式pcr芯片。

本微液滴式pcr芯片是先采用光刻工艺制造盖片10，再将盖片10与基片贴合而成。盖片10中的填充腔14和16、pcr反应腔15及排液流道17的厚度要大于油相试剂流道11、pcr反应液流道12及混合流道13的厚度(所述厚度为图1或图2垂直于图面方向的尺寸)，因此需要采用两个掩膜板分别成型盖片10的不同厚度区域。

具体而言，在s210中，先行制备所述基片、衬底和第一掩膜板、第二掩膜板。其中，第一掩膜板用于成型图1中的油相试剂流道11、pcr反应液流道12和混合流道13，第一掩膜板具有第一图案，第一图案包括对应油相试剂流道11的图形、pcr反应液流道12的图形，以及混合流道13的图形。第二掩膜板则用于成型填充腔14和16、pcr反应腔15和排液流道17。第二掩膜板具有第二图案，第二图案包括对应填充腔14的图形、pcr反应腔15的图形、填充腔16的图形，以及排液流道17的图形。第一图案和第二图案中各个图形的形状、尺寸与位置分布，与最终成型的盖片10的各个流道或腔室的形状、尺寸及位置分布相对应。

在s220中，使用第一掩膜板和第二掩膜板，通过光刻工艺在衬底上形成第一阳模和第二阳模。其中，第一阳模上形成有与第一图案对应的图形。即第一阳模上形成有油相试剂流道11的图形、pcr反应液流道12的图形，以及混合流道13的图形。第二阳模上形成有与第二图案对应的图形。即第二阳模上形成有两个填充腔14和16的图形、pcr反应腔15的图形，以及排液流道17的图形。并且，第一阳模和第二阳模并排拼接，使得第一阳模和第二阳模上的图形相连而拼接成对应盖片10的各个流道或腔室的完整图形。例如，第一阳模中混合流道13的图形的两端中，靠近封闭腔14的一端与封闭腔14拼接。

进一步的，在s220中，所述使用所述第一掩膜板和所述第二掩膜板，通过光刻工艺在所述衬底上形成并排拼接的第一阳模和第二阳模可以包括：

s221，在所述衬底上涂覆第一光刻胶层并进行烘烤。例如，使用表面干净的3英寸硅片作为衬底，在衬底上倒上1ml的su8-3050光刻胶并在匀胶机上进行旋涂。可以设置匀胶机以500rpm的转速旋转15秒，再以3000rpm的转速旋转30秒的参数完成涂胶，最终形成50微米左右高度的第一光刻胶层。然后，对第一光刻胶层进行烘烤，令光刻胶中的溶剂充分逸出，使第一光刻胶层干燥。例如，可以使用65摄氏度的热板烘烤1分钟，再升温至95摄氏度继续烘烤15分钟。

s222，通过曝光将所述第一掩膜板上的所述第一图案转印到所述第一光刻胶层上，以在所述第一光刻胶层上形成与所述第一图案对应的油相试剂流道11的图形、pcr反应液流道12的图形，以及混合流道13的图形，之后除去所述第一掩膜板。应理解，经过曝光之后，第一图案中的全部图形都已转印到了第一光刻胶层。另外，步骤s222完成之后，并不立刻进行显影，而是使用第二掩膜板进行第二图案的转印。

s223，在所述衬底上涂覆第二光刻胶层并进行烘烤，所述第二光刻胶层与所述第一光刻胶层并排拼接。例如，在衬底上倒上1ml的su8-3100光刻胶并在匀胶机上进行旋涂。可以设置匀胶机以500rpm的转速旋转15秒，再以3000rpm的转速旋转30秒的参数完成涂胶，最终形成50微米左右高度的第二光刻胶层，第二光刻胶层与第一光刻胶此是并排拼接的。然后，对第二光刻胶层进行烘烤，令光刻胶中的溶剂充分逸出，使第二光刻胶层干燥。例如，可以使用65摄氏度的热板烘烤1分钟，再升温至95摄氏度继续烘烤30分钟。

s224，通过曝光将所述第二掩膜板上的所述第二图案转印到所述第二光刻胶层上，以在所述第二光刻胶层上形成与所述第二图案对应的pcr反应腔15的图形、排液流道17的图形，以及两个填充腔14和16的图形，之后除去所述第二掩膜板。应理解，经过曝光之后，第二图案中的全部图形都已转印到了第二光刻胶层。而且，第二光刻胶层上的图形与第一光刻胶层上的图形相连而拼接成对应盖片10的各个流道或腔室的完整图形。在s224中除去第二掩膜板后，还可以对光刻胶层进行烘烤。例如可以使用65摄氏度的热板烘烤1分钟，再升温至95摄氏度继续烘烤5分钟，以此来使光刻胶中的溶剂充分逸出。

s225，去除未固化的光刻胶并做坚膜处理，得到所述第一阳模和所述第二阳模。例如，可以使用su8显影液对第一阳模和第二阳模中未固化的光刻胶进行显影去除。最后再使用150摄氏度的热板进行坚膜处理，使残留的光刻胶中的溶剂全部挥发，以提高第一阳模和第二阳模中的光刻胶与衬底之间的粘附性，以及光刻胶的抗腐蚀能力。

在s240中，将所述第一阳模和所述第二阳模上的图形进行转印，得到所述盖片基体，所述盖片基体实为盖片10的雏形。所述盖片基体包括未开设pcr反应液注入口121的pcr反应液流道12、未开设有油相试剂注入口113的油相试剂流道11、混合流道13、pcr反应腔15、排液流道17，及两个填充腔14和16。

进一步的，在s240中，所述以所述第一阳模和所述第二阳模为模板形成盖片基体包括：

s241，在所述第一阳模和所述第二阳模上浇注模型胶，经脱气泡、固化后揭膜，得到所述盖片基体。所述模型胶例如可以是聚二甲基硅氧烷(pdms)。其中，pdms中a胶与b胶的质量比可以为1：10。所述固化处理例如可以是在80摄氏度的烘箱中烘烤30分钟。经过脱气泡、固化后，第一阳模和第二阳模中的图形能够可靠地转印到模型胶。然后揭下的形成有图形的模型胶层，即为所述盖片基体。

进一步的，在s220与s240之间，本制造方法200还可以包括：

s230，使用脱模剂处理所述第一阳模和所述第二阳模，以使后续步骤s240中所述的揭膜更为顺利。所述脱模剂例如可以是三氯甲基硅氧烷。

在s250中，在所述盖片基体的填充腔14和16内填充热膨胀颗粒，并在所述盖片基体上加工出油相试剂注入口113、pcr反应液注入口121及排液流道17的排液口171，最终得到盖片10。应理解，盖片基体的成型过程中已经形成了混合入口131和液滴出口132，因而无需额外打孔。

在s260中，例如可以将盖片10与基片一起放入等离子体清洗机清洗，待清洗完成后取出，将盖片10与基片对准键合封装，最终形成完整的微液滴式pcr芯片。

本实施例的制造方法200，使用光刻工艺能够方便快捷地成型具有微通道结构的盖片10，且成本低廉；通过使用两个掩膜板分别进行光刻，便于形成不同厚度的光刻胶图案层、最终成型盖片10的不同厚度区域；通过形成两个填充腔，并在两个填充腔中填充热膨胀颗粒，能够使得微液滴式pcr芯片具有封闭阀门。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易的想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。