一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的寡养单胞菌的制作方法

本发明属于环境污染微生物处理技术领域，具体涉及一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的寡养单胞菌。

背景技术：

烟草（nicotianatabacum）属茄科一年生或有限多年生草本植物，起源于南美洲，目前种植遍布世界各地。烟草是一种特殊的经济作物，我国自1982年实行烟草专卖制度以来，烟草行业得到长足发展并成为国民经济的一个重要支柱产业。烟草在我国南北各省区均有种植，其主要用途为加工烟叶生产卷烟。因此，优质的烟叶是烟草生产的重要目标，如何保证优质的烟叶也是烟农关心的重要问题。在福建，烟草种植主要以稻烟轮作方式为主，然而上茬作物水稻常用的农药如除草剂的使用，严重影响了后茬烟草的生长。烟草对除草剂较为敏感，随着除草剂在水稻田的广泛使用，烟草生产受到除草剂药害的现象时有发生，给烟草生产带来极大的危害。

已有研究表明二氯喹啉酸施用后，在美国阿肯色州有研究者检测到水稻田附近水域二氯喹啉酸的残留量可达µg/l级;利用测渗计模拟水稻田施用二氯喹啉酸的环境行为，结果表明95%残留在水稻田的30cm表层土壤中。土壤中残留的二氯喹啉酸会影响烟草植株的畸形生长，导致新叶向叶背卷缩，随后逐渐发展成线状鼠尾状叶形。由于二氯喹啉酸的药害，烤烟的产量和产值均明显降低，严重危害时可降低80%以上，甚至绝收。

微生物法降解残留农药具有环境友好，无污染，高效等特点，因此利用生物进行环境修复是近年来的研究热点。本发明通过田间长期使用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选获得降解菌株，本发明所采用的菌株为泛菌属菌株，目前尚未见泛菌属用于土壤残留二氯喹啉酸降解的报道；本发明菌株来源于土壤，具有环境友好的特点。采用生物法解除烟田残留除草剂二氯喹啉酸不仅能降低药害带给烟草的经济损失，而且也对保护环境，净化土壤有不可小觑的意义。

技术实现要素：

为解决上述二氯喹啉酸在土壤中残留导致烟草产量和产值降低的问题，本发明提供一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的寡养单胞菌。该菌株可有效降解土壤中残留的二氯喹啉酸，从而提高烟草产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的寡养单胞菌，经鉴定，所述菌株为寡养单胞菌j3（stenotrophomonassp.j3），已保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072；保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为cctccno:m2017128。

本发明菌株j3通过如下方法富集得到：

本实验从福建烟田采集土壤，利用富集法筛选获得，其筛选过程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤与100mlmm培养基混合，并加入二氯喹啉酸使其终浓度为100µg/ml，于30℃，150r/min培养1周；取培养液1ml加入100ml含同样浓度除草剂的新鲜培养基中，同时于固体培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养1周；连续转代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株。

（2）液相色谱测定该菌降解率：将所得菌株分别置于含有5µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培养基中培养，以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的mm培养基为参照，利用高效液相色谱法进行测定；取样时间分别为第6d和第23d，样品体积为1ml；将样品在8000r/min条件下离心10min,上清液经0.22µm滤膜过滤后用于hplc分析，每个处理三次重复。hplc检测条件为：固定相为c18柱（4.6×250nm，5µm，安捷伦）；流动相为甲醇+0.5%乙酸水（体积比为65:35）；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积为10µl。

利用（2）中所述检测条件对该菌株的二氯喹啉酸降解能力进行检测，并通过下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

本发明所述的菌株j3可用于降解二氯喹啉酸。

本发明的优点在于：

本发明通过田间长期使用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选获得降解菌株，采用生物法降解烟田残留除草剂二氯喹啉酸不仅能降低药害带给烟草的经济损失，而且也对保护环境，净化土壤有不可小觑的意义。

附图说明

图1富集法筛选可降解二氯喹啉酸的微生物菌株流程图；

图2j3菌落形态图：菌落呈黄色、圆形、隆起、不透明、边缘整齐；

图3标准品二氯喹啉酸（5mg/l）在mm培养基及甲醇中的色谱图：a为mm培养基，b为添加菌液的mm培养基，c为添加二氯喹啉酸的mm培养基，d为溶解在甲醇中的二氯喹啉酸；

图4高效液相色谱法检测二氯喹啉酸的标准曲线；

图5mm培养基中添加菌株j3培养6d和23d后对二氯喹啉酸的降解率。

具体实施方式

实施例1菌株j3的筛选

本试验从烟田采集土壤，利用富集法筛选可降解二氯喹啉酸的微生物菌株，过程如图1所示。本试验筛选得到一株可以降解土壤二氯喹啉酸的菌株，将其命名为j3；其筛选过程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤与100mlmm培养基混合，并加入二氯喹啉酸使其终浓度为100µg/ml，于30℃，150r/min培养1周；取培养液1ml加入100ml含同样浓度除草剂的新鲜培养基中，同时于固体培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养1周；连续转代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈黄色、圆形、隆起、不透明、边缘整齐；其菌落形态图见图2。

（2）液相色谱测定该菌降解率：将所得菌株分别置于含有5µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培养基中培养，以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的mm培养基为参照，利用高效液相色谱法进行测定；取样时间分别为第6d和第23d，样品体积为1ml；将样品在8000r/min条件下离心10min,上清液经0.22µm滤膜过滤后用于hplc分析，每个处理三次重复。hplc检测条件为：固定相为c18柱（4.6×250nm，5µm，安捷伦）；流动相为甲醇+0.5%乙酸水（体积比为65:35）；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积为10µl。其色谱图见图3，结果表明在该条件下，可以很好的地将二氯喹啉酸的目标峰与杂质分离开。

（3）制作标准曲线：用色谱甲醇配制得到500µg/ml二氯喹啉酸标准储备溶液，再用色谱甲醇稀释得到0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0和10.0µg/ml二氯喹啉酸系列标准工作溶液。将标准溶液分别进样，获得的峰面积与药液浓度作相关图，求相关系数。标准曲线如图4所示，结果表明不同浓度二氯喹啉酸与峰面积间的线性相关系数r为0.9980；表明二氯喹啉酸含量与响应值呈良好的线性关系。

利用（2）中所述检测条件对该菌株的二氯喹啉酸降解能力进行测定，并通过下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

测定结果如图5所示，表明培养6d后，菌株j3对二氯喹啉酸的降解率为10.3%；培养23d后，菌株j3对二氯喹啉酸的降解率为33.5%。由此可见菌株j3对土壤中的二氯喹啉酸具有较佳的降解能力。

实施例2分子鉴定

利用细菌16srdna通用引物fd2/rp1，通过菌落pcr扩增菌株的16srdna测序后进行对比分析鉴定菌株：

fd2：5’-agagtttgatcatggctcag-3’，

rp1：5’-acggttaccttgttacgactt-3’；

pcr反应体系：pcr反应体系为：1×pcrmix反应液（全式金生物科技有限公司，北京），0.4μm引物，并利用牙签挑取少量菌落作为模板；

pcr反应程序：95℃预变性4min后进行32次循环，每次循环包括95℃变性30s，58℃退火30s及72℃延伸1min；最后在72℃再延伸10min。

pcr产物j3-16srdna经琼脂糖凝胶电泳验证后进行dna回收、测序，测序结果与genbank数据库进行比对。结果显示，本发明筛选所得菌株j3与genbank中的寡养单胞菌属嗜麦芽寡养单胞菌（stenotrophomonasmaltophilia）同源性达100%，其同源序列登录号为nr_112030.1。经鉴定，菌株为寡养单胞菌j3（stenotrophomonassp.j3），已保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072；保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为cctccno:m2017128。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>中国烟草总公司福建省公司

福建农林大学

<120>一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的寡养单胞菌

<130>3

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>fd2

<400>1

agagtttgatcatggctcag20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>rp1

<400>2

acggttaccttgttacgactt21

<210>3

<211>1411

<212>dna

<213>j3-16srdna

<400>3

gcagtcgacggcagcacaggagagcttgctctctgggtggcgagtggcggacgggtgagg60

aatacatcggaatctactttttcgtgggggataacgtagggaaacttacgctaataccgc120

atacgacctacgggtgaaagcaggggaccttcgggccttgcgcgattgaatgagccgatg180

tcggattagctagttggcggggtaaaggcccaccaaggcgacgatccgtagctggtctga240

gaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagt300

ggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccataccgcgtgggtgaagaaggc360

cttcgggttgtaaagcccttttgttgggaaagaaatccagccggctaatacctggttggg420

atgacggtacccaaagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacga480

agggtgcaagcgttactcggaattactgggcgtaaagcgtgcgtaggtggtcgtttaagt540

ctgttgtgaaagccctgggctcaacctgggaactgcagtggaaactggacgactagagtg600

tggtagagggtagcggaattcctggtgtagcagtgaaatgcgtagagatcaggaggaaca660

tccatggcgaaggcagctacctggaccaacactgacactgaggcacgaaagcgtggggag720

caaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgcgaactggatgttgggt780

gcaatttggcacgcagtatcgaagctaacgcgttaagttcgccgcctggggagtacggtc840

gcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggttt900

aattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtcgagaactttccagagat960

ggatgggtgccttcgggaactcgaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcg1020

tgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgccagcacgta1080

atggtgggaactctaaggagaccgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtca1140

agtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtactacaatggtggggacagagggc1200

tgcaagccggcgacggtaagccaatcccagaaaccccatctcagtccggattggagtctg1260

caactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaa1320

tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaag1380

caggtagcttaaccttcgggagggcgctgcc1411