专利名称：一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法
一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法技术领域一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，涉及一种农药代谢物残留检测方法，更具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测纺织品原料棉花中的甲基对氧磷的残留，属于免疫分析技术领域。
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上世纪60年代以来的研究进一步发现，除了农药本身以外，它的代谢产物 也会出现残留毒性问题，且毒性比农药母体还要强。这一发现不仅促使加强了 对农药残留降解的研究，还引发了对农药降解过程中代谢产物毒性的研究。甲 基对硫磷(M 1605)是常见的有机磷农药，而甲基对氧磷(M 1600)为其代谢产物。 甲基对氧磷的毒性，比原母体甲基对硫磷毒性更大。甲基对硫磷在喷洒作物上 消失很快，在短期内，少量的甲基对硫磷己转变为甲基对氧磷而增加毒性。因 而检测甲基对氧磷的残留成为一种必要，而且还可以作为甲基对硫磷的接触生 物标志物。<formula>formula see original document page 3</formula>甲基对硫磷(Parathion-methyl) 甲基对氧磷(Paraoxon-methyl)既往甲基对氧磷检测多用液相色谱法，仪器昂贵，纯化费时，且需要专门人 员操作。酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量甲基对氧磷检测的快速、 灵敏、选择性的检测方法。张卫国，马兆扬合成了甲基对氧磷的人工抗原并进 行了鉴定，得到了较好的多克隆抗体。但只对抗体的效价、特异性进行了测定。 目前还缺少对实际样本中的甲基对氧磷残留检测建立ELISA方法。 发明内容本发明的目的在于提供一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，是一种快速 检测纺织品中甲基对氧磷农药代谢物残留的免疫学检测方法，使样品无需经过 繁琐的提纯或浓縮步骤，并且保证较高的敏感性和特异性。本发明的技术方案利用尹丽梅、胥传来、袁媛等(一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法[P].中国专利CN101172984A)合成的0， O-二甲 基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯为半抗原，此半抗原与BSA偶联作为免疫原免疫 健康新西兰大白兔得到多克隆抗体，半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了纺织品中甲基对氧磷农药残留的间接竞争酶联免疫方法。 一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，步骤如下(1) 抗原的包被以半抗原O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯与卵清蛋白OVA的偶联复合物作为包被抗原，以0.05M、 pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原 1:32000 1:64000，浓度为0.625 1.25^ig/mL作为包被液，在酶标板的每孔中 加入100pL， 4t:孵育过夜，然后用含0.1%明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封 闭液，封闭2h;(2) 竞争反应将免疫制备的甲基对氧磷多克隆抗体用抗体稀释液含0.1%明胶、含 0.05%吐温-20、 pH7.4、 O.OIM的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1:2000 1:4000 比例稀释后，加入酶标板中，每孔加5(HiL，同时每孔分别加入标准品稀释 液PBST稀释的0.01吗/mL、 0.1jig/mL、 0.5吗/mL、 l吗/mL、 5吗/mL、 10吗/mL、 20吗/mL系列浓度之一的甲基对氧磷标准品50jiL， 37'C孵育lh后以PBST 洗涤液洗涤3~5次；(3) 加酶标二抗加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液稀释为1:5000， 每孔加100fiL， 37'C温育lh后以PBST洗涤液洗涤3 5次；(4) 显色每孔加入100jiL显色液，暗处37'C反应15min，取出后每孔加入100 (iL、 2mol/L的硫酸终止液，用酶标仪测定吸光值A450，与所作的标准曲线对比算出 待测样品的甲基对氧磷浓度。显色液配方A液0.933 g柠檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 nL30%H2O2 用超纯水定容至lOOmL; B液60mg3,3^5^-四甲基联苯胺溶于100mL乙二 醇中；使用前将A液与B液以5:1体积混合。标准品稀释液PBST为含0.15mol/LNaCl、含0. 5%Tween-20的O.01mol/L、 pH7.4 PBST溶液。1、主要溶液配制1) 配制0.01M磷酸盐缓冲液(PBS):Na2HP04.12H20 3,62 g， KH2P04 0.2 g，KC1 0.2g，NaCl 8.0g，加超纯水稀释至lOOOmL。2) 配置0.05M、 pH9.6碳酸盐缓冲溶液(CBS)Na2C03 1.59g， NaHC03 2.93g，加超纯水稀释至1000 mL。3) 配制PBST溶液含0.05% Tween-20的PBS溶液。4) 配制封闭液含0.lQ/^明胶的碳酸盐缓冲液5) 配制抗体稀释液含0.1W明胶的PBST溶液。6) 配制标准品稀释液含0.15mol/LNaCl、含0. 5%Tween-20的O.01mol/L、 pH 7.4PBST溶液。7) 显色液A液0.933 g柠檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 [xL30%H2O2,用超纯水 定容至100 mL;B液60mg3，3;5，5Z-四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前将A液与B液以5:1体积混合。8) 终止液2M的H2S04。本发明的有益效果本发明建立了纺织品中甲基对氧磷农药的间接ELISA 方法，为纺织品中甲基对氧磷农药残留检测提供了快速高效的检测手段，由于 采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为O.Olppm， 线性范围为0.1 20ppm，半数抑制量(ICs。)为1.27pg/mL，回收率为78.9%，与 其他有机磷农药几乎无交叉反应。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具 有极高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。
图1甲基对氧磷的标准抑制曲线。 具体实施方案以下通过实施例进一步说明本发明。仪器TGL — 40B台式低速离心机上海安亭科学仪器厂，KFLO纯水机凯佛隆公司，ZD-9556水平摇床太仓科教器材厂，Costar96孔8xl2可拆酶标板上海吉泰生物科技有限公司， MuLtiska Mks酶标仪 Thermo Labsystems公司， 可调试移液器 Thermo Labsystems公司，涡旋混合器上海沪西仪器分析厂。 试剂-辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)康成生物工程公司， 四甲基联苯胺(TMB)华美生物工程公司， 其他试剂均为分析纯试剂实施例l、间接竞争ELISA实验方法的步骤如下预先将甲基对氧磷标准品配制成lOOOpg/mL的甲醇溶液作为工作母液，在4。C保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L， pH7.4, 0.15mol/L NaCl, 0. 5%Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和抗血清。a、 包被:用设定浓度的包被原包被酶联反应板，100pL/ L， 4"C过夜。b、 洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min， 200jiL/ L然后甩干反应板。c、 封闭:含0.1。/。明胶的CBS， 200(iL/孔.37-C封闭2h。d、 洗涤:同be、 竞争:用标准品稀释液PBST将甲基对氧磷母液稀释成0.01pg/mL， 0.1pg/mL， 0.5吗/mL, l吗/mL， 5昭/mL， 10吗/mL, 20吗/mL系列浓度，另设一个标准 品稀释液PBST空白对照，50pL /孔。然后每孔加入50pL稀释4000倍的抗血 清，于37。C温育lh。f、 洗涤:同bg、 加酶标二抗(羊抗兔HRP-IgG， 1:5000), lOOiaL/孔，37 C反应lh。h、 洗涤:同bi、 显色加底物TMB100pL/ L,显色15min。 j、终止:加终止液100pL/孔。k、测定:用酶标仪检测OD450nm。实施例2、实际样本检测取阴性样本(棉花)为代表性样品，将其剪碎至5mmx5mm—下，混匀。 分别称取1.0g试样置于lOOmL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的甲基对氧磷标 准品的丙酮溶液加入其中，使甲基对氧磷在棉花中的终浓度分别为0.1pg/g、 l吗/g、 10pg/g，室温静置15min。在锥形瓶中加入20mL乙酸乙酯，于超声波 发生器中提取20min，将提取液滤出。残渣再用10mL乙酸乙酯超声提取5min， 将两次滤液合并。将滤液在4(TC水浴旋转蒸发器中浓縮至近干，用丙酮溶解并 定容至lmL，然后用氮气吹干，以含10%-20%甲醇的PBS溶解，用于ELISA 检测；由于甲基对氧磷具有一定的疏水性及非极性，极易吸附于玻璃器皿壁上， 溶解时要充分振荡。实施例3、回收率及样品提取方法的确定取阴性样本(棉花)为代表性样品，将其剪碎至5mmx5mm—下，混匀。 分别称取1.0g试样置于lOOmL具塞锥形瓶中，然后将一定浓度的甲基对氧磷标 准品的丙酮溶液加入其中，使甲基对氧磷在棉花中的终浓度分别为0.1pg/g、 l|ig/g、 10pg/g，室温静置15min。在锥形瓶中加入20mL乙酸乙酯，于超声波发生器中提取20min，将提取液 滤出。残渣再用10mL乙酸乙酯超声提取5min，将两次滤液合并。将滤液在4(TC水浴旋转蒸发器中浓縮至近干，用丙酮溶解并定容至lmL， 然后用氮气吹干，以含10—20X甲醇的PBS溶解。移取50pL样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。 回收率的计算根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根据相应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。试验结果如下标准曲线本方法所获得的抗原检测的线性范围是为0.1 20pg/mL，具体请见 说明书附图。灵敏度灵敏度是所得90%空白孔吸光值所对应的标准品的浓度，即1<:90为 0.01pg/mL。交叉反应率(Cross Reactive, C.R%)将几种结构相近的有机磷农药进行交叉反应研究。C50(甲基对氧磷) ，_n/CR =-1-^~ x 100%lCso(其他有机磷农药)ICso是抑制率为50%时各有机磷农药标准品的浓度。从下表数据可知与其他类 似结构有机磷农药的交叉反应率很低，说明此抗体具有较好的特异性。表1交叉反应率测定结果名称(name)IC50(pg/mL)C.R%甲基对氧磷(paraoxon-methyl)1.27100甲基对硫磷(parathion-methyl)139.7对氧磷(paraoxon)10.711.8对硫磷(parathion)〉100<1敌敌畏(dichlorvos)245.3速灭磷(mevinphos)>1000一回收率测定加标棉花样品后进行ELISA测定，结果见下表。回收率在78% 117%之间。表2 ELISA检测加标样品回收率结果甲基对氧磷添加量(pg/g)检出量(pg/g)回收率(％)0. 10. 11711710. 91491. 4107. 88478. 8权利要求
1、一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，其特征在于步骤如下(1)抗原的包被以半抗原O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯与卵清蛋白OVA的偶联复合物作为包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1∶32000～1∶64000，浓度为0.625～1.25μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；(2)竞争反应将免疫制备的甲基对氧磷多克隆抗体用抗体稀释液含0.1％明胶、含0.05％吐温-20、pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1∶2000～1∶4000比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，同时每孔分别加入标准品稀释液PBST稀释的0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL系列浓度之一的甲基对氧磷标准品50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(3)加酶标二抗加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液稀释为1∶5000，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(4)显色每孔加入100μL显色液，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸终止液，用酶标仪测定吸光值A450，与所作的标准曲线对比算出待测样品的甲基对氧磷浓度。
2、 根据权利要求l所述的甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，其特征在于显 色液配方A液:0.933 g柠檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 |iL30°/0H2O2用 超纯水定容至100 mL; B液60 mg 3，3^^-四甲基联苯胺溶于100 mL乙二醇 中；使用前将A液与B液以5:1体积混合。
3、 根据权利要求l所述的甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，其特征在于标 准品稀释液PBST为含0.15mol/LNaCl、含0. 5%Tween-20的0.01mol/L、pH 7.4 PBST溶液。
全文摘要
一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明利用合成的甲基对氧磷免疫原免疫获得到多克隆抗体，以甲基对氧磷为标准品，以甲基对氧磷半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了纺织品(棉花)中甲基对氧磷的间接竞争酶联免疫分析方法。本发明建立了纺织品中甲基对氧磷农药代谢物的间接ELISA方法，为甲基对氧磷在纺织品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.01ppm，线性范围为0.1-20ppm。免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。
文档编号G01N33/543GK101334409SQ20081002122
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月22日 优先权日2008年7月22日
发明者尹丽梅, 彭池方, 徐一平, 殷祥刚, 胥传来, 媛 袁, 伟 马 申请人:江南大学