一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株的制作方法

本发明属于环境污染微生物处理技术领域，具体涉及一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株。

背景技术：

烟草（nicotianatabacum）属茄科一年生或有限多年生草本植物，起源于南美洲，目前种植遍布世界各地。烟草是一种特殊的经济作物，我国自1982年实行烟草专卖制度以来，烟草行业得到长足发展并成为国民经济的一个重要支柱产业。烟草在我国南北各省区均有种植，其主要用途为加工烟叶生产卷烟。因此，优质的烟叶是烟草生产的重要目标，如何保证优质的烟叶也是烟农关心的重要问题。在福建，烟草种植主要以稻烟轮作方式为主，然而上茬作物水稻常用的农药如除草剂的使用，严重影响了后茬烟草的生长。烟草对除草剂较为敏感，随着除草剂在水稻田的广泛使用，烟草生产受到除草剂药害的现象时有发生，给烟草生产带来极大的危害。

已有研究表明二氯喹啉酸施用后，在美国阿肯色州有研究者检测到水稻田附近水域二氯喹啉酸的残留量可达µg/l级;利用测渗计模拟水稻田施用二氯喹啉酸的环境行为，结果表明95%残留在水稻田的30cm表层土壤中。土壤中残留的二氯喹啉酸会影响烟草植株的畸形生长，导致新叶向叶背卷缩，随后逐渐发展成线状鼠尾状叶形。由于二氯喹啉酸的药害，烤烟的产量和产值均明显降低，严重危害时可降低80%以上，甚至绝收。

克雷伯氏菌属（klebsiellaspp.）的一些种类是重要的条件致病菌和医源性感染菌，其中以肺炎克雷伯氏菌（klebsiellapneumoniae）对人致病性最强，但在农业微生物和工业污染治理等方面的研究表明，克雷伯氏菌对植物本身不表现致病性，而且还是一种绿色菌肥和高效净化剂。克雷伯氏菌普遍分布于禾本科植株的根部以及土壤中，是一种丰富的根系联合固氮微生物资源，与植物在长期进化和系统发育过程中建立起紧密的合作关系，对植物的生长及代谢起着间接的促进作用。关于克雷伯氏菌的研究已有很多报道，研究主要涉及克雷伯氏菌菌株促进土壤营养物质转化、降解苯类有机物、作为铁载体等方面。本发明提供了一株具有降解二氯喹啉酸的克雷伯氏菌。

微生物法降解残留农药具有环境友好，无污染，高效等特点，因此利用生物进行环境修复是近年来的研究热点。本发明通过田间长期使用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选获得降解菌株，采用生物法解除烟田残留除草剂二氯喹啉酸不仅能降低药害带给烟草的经济损失，而且也对保护环境，净化土壤有不可小觑的意义。

技术实现要素：

为解决上述二氯喹啉酸在土壤中残留导致烟草产量和产值降低的问题，本发明提供一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株。该菌株可有效降解土壤中残留的二氯喹啉酸，从而提高烟草产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株，经鉴定，所述菌株为克雷伯氏菌j5（klebsiellasp.j5)；保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮政编码：430072；保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为cctccno:m2017130。

本发明菌株j5通过如下方法富集得到：

本实验从福建烟田采集土壤，利用富集法筛选获得，其筛选过程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤与100mlmm培养基混合，并加入二氯喹啉酸使其终浓度为100µg/ml，于30℃，150r/min培养1周；取培养液1ml加入100ml含同样浓度除草剂的新鲜培养基中，同时于固体培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养1周；连续转代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐。

（2）液相色谱测定该菌降解率：将所得菌株分别置于含有5µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培养基中培养，以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的mm培养基为参照，利用高效液相色谱法进行测定；取样时间分别为第6d和第23d，样品体积为1ml；将样品在8000r/min条件下离心10min,上清液经0.22µm滤膜过滤后用于hplc分析，每个处理三次重复。hplc检测条件为：固定相为c18柱（4.6×250nm，5µm，安捷伦）；流动相为甲醇+0.5%乙酸水（体积比为65:35）；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积为10µl。

利用（2）中所述检测条件对该菌株的二氯喹啉酸降解能力进行检测，并通过下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

本发明所述的菌株j5可用于降解二氯喹啉酸。

本发明的优点在于：

本发明通过田间长期使用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选获得降解菌株，采用生物法降解烟田残留除草剂二氯喹啉酸不仅能降低药害带给烟草的经济损失，而且也对保护环境，净化土壤有不可小觑的意义。

附图说明

图1富集法筛选可降解二氯喹啉酸的微生物菌株流程图；

图2j5菌落形态图：菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐；

图3标准品二氯喹啉酸（5mg/l）在mm培养基及甲醇中的色谱图。a为mm培养基，b为添加菌液的mm培养基，c为添加二氯喹啉酸的mm培养基，d为溶解在甲醇中的二氯喹啉酸；

图4高效液相色谱法检测二氯喹啉酸的标准曲线；

图5mm培养基中添加菌株j5培养6d和23d后对二氯喹啉酸的降解率；

图6土壤中不同浓度二氯喹啉酸对烟苗生长的影响：从左至右依次分别表示未加药的清水对照（ck），添加0.001µg/g、0.01µg/g及0.1µg/g二氯喹啉酸的处理；

图7土壤中含不同浓度二氯喹啉酸对烟苗生长各指标的影响：叶面积（a）、叶片数（b）、株高（c）的影响；

图8菌株j5在含二氯喹啉酸的土壤中对烟苗生长的影响：a图从左至右依次分别表示清水对照（ck）、添加菌株j5、添加0.01µg/g二氯喹啉酸、同时添加菌株j5和0.01µg/g二氯喹啉酸的处理；b图从左至右依次分别表示清水对照（ck）、添加菌株j5、添加0.1µg/g二氯喹啉酸、同时添加菌株j5和0.1µg/g二氯喹啉酸的处理；

图9菌株j5在含二氯喹啉酸的土壤中对烟苗各生长指标的影响：横坐标从左至右依次分别表示清水对照（ck）、添加菌株j5、0.01µg/g及0.1µg/g二氯喹啉酸、同时添加菌株j5和0.01及0.1µg/g二氯喹啉酸的处理；a图为以上条件对叶面积的影响，b图为对叶片数的影响，c图为对株高的影响。

具体实施方式

实施例1菌株j5的筛选

本试验从烟田采集土壤，利用富集法筛选可降解二氯喹啉酸的微生物菌株，过程如图1所示。本试验筛选得到一株可以降解土壤二氯喹啉酸的菌株，将其命名为j5；其筛选过程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤与100mlmm培养基混合，并加入二氯喹啉酸使其终浓度为100µg/ml，于30℃，150r/min培养1周；取培养液1ml加入100ml含同样浓度除草剂的新鲜培养基中，同时于固体培养基划线以确认有细菌生长，同样条件培养1周；连续转代培养10次后，经平板划线分离，获得单菌落菌株。该菌为革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色，表面光滑，圆形，边缘整齐；其菌落形态图见图2。

（2）液相色谱测定该菌降解率：将所得菌株分别置于含有5µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培养基中培养，以不加菌液只含相同浓度二氯喹啉酸的mm培养基为参照，利用高效液相色谱法进行测定；取样时间分别为第6d和第23d，样品体积为1ml；将样品在8000r/min条件下离心10min,上清液经0.22µm滤膜过滤后用于hplc分析，每个处理三次重复。hplc检测条件为：固定相为c18柱（4.6×250nm，5µm，安捷伦）；流动相为甲醇+0.5%乙酸水（体积比为65:35）；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为240nm；进样体积为10µl。其色谱图见图3，结果表明在该条件下，可以很好的地将二氯喹啉酸的目标峰与杂质分离开。

（3）制作标准曲线：用色谱甲醇配制得到500µg/ml二氯喹啉酸标准储备溶液，再用色谱甲醇稀释得到0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0和10.0µg/ml二氯喹啉酸系列标准工作溶液。将标准溶液分别进样，获得的峰面积与药液浓度作相关图，求相关系数。标准曲线如图4所示，结果表明不同浓度二氯喹啉酸与峰面积间的线性相关系数r为0.9980；表明二氯喹啉酸含量与响应值呈良好的线性关系。

利用（2）中所述检测条件对该菌株的二氯喹啉酸降解能力进行测定，并通过下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

测定结果如图5所示，表明培养6d后，菌株j5对二氯喹啉酸的降解率为20.5%；培养23d后，菌株j5对二氯喹啉酸的降解率为40.1%。由此可见菌株j5对土壤中的二氯喹啉酸具有较佳的降解能力。

实施例2分子鉴定

利用细菌16srdna通用引物fd2/rp1，通过菌落pcr扩增菌株的16srdna测序后进行对比分析鉴定菌株：

fd2：5’-agagtttgatcatggctcag-3’，

rp1：5’-acggttaccttgttacgactt-3’；

pcr反应体系：pcr反应体系为：1×pcrmix反应液（全式金生物科技有限公司，北京），0.4μm引物，并利用牙签挑取少量菌落作为模板；

pcr反应程序：95℃预变性4min后进行32次循环，每次循环包括95℃变性30s，58℃退火30s及72℃延伸1min；最后在72℃再延伸10min。

pcr产物j5-16srdna经琼脂糖凝胶电泳验证后进行dna回收、测序，测序结果与genbank数据库进行比对。结果显示，本发明筛选所得菌株j5的序列与genbank中的克雷伯氏菌klebsiellavariicola（登录号nr_025635.1）以及克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae（登录号nr_112009.1）同源性达99%。经鉴定，菌株j5为克雷伯氏菌（klebsiellasp.)，编号j5，已保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮政编码：430072；保藏日期为2017年3月16日，保藏编号为cctccno:m2017130。

实施例3烟苗实验：菌株j5的防治效果

（1）测定土壤中药液对烟苗产生药害的的浓度：分别配置含有0、0.001、0.01和0.1µg/g二氯喹啉酸药液的营养土，均匀搅拌后等量装入花盆，移栽入生长情况相似的烟苗，40天后观察烟草生长情况，并测定烟苗株高、叶面积和叶片数等参数。每处理5次重复。结果表明当二氯喹啉酸为0.001µg/g土壤时，药害不明显；当二氯喹啉酸为0.01µg/g和0.1µg/g土壤时，药害明显（图6）。药害主要表现为叶片面积缩小，同时对株高有一定的影响，但是对叶片数无明显抑制作用（图7）。

（2）测定菌株j5在有二氯喹啉酸药害的土壤中对烟苗生长的影响：分别配置含有0.01和0.1µg/g药液的营养土，均匀搅拌后等量装入花盆。然后添加100ml新鲜菌液(od=0.2)于土壤中。试验中设置处理包括：清水对照（ck）、添加菌株j5、添加二氯喹啉酸、同时添加菌株j5和二氯喹啉酸的营养土处理，每个处理包括5次重复。7d后将生长情况相近的烟苗移栽入花盆中，于温室中自然光照下培养40d，调查不同处理中烟苗的生长情况，并测定烟苗株高、叶面积和叶片数等参数。

烟苗生长情况如图8所示，各生长指标情况如图9所示。图8表明在产生药害的土壤中添加菌液后，发现菌株j5能明显降低药害作用。图9表明，与不加菌液只含药剂的处理相比，j5菌株能显著增大最大叶面积，且对增加叶片数及提高株高度也有一定作用。烟苗试验结果与mm培养基中检测到的降解效果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

中国烟草总公司福建省公司

<120>一株能够降解土壤残留二氯喹啉酸的菌株

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