本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种应用高分辨率熔解曲线技术鉴定杭白菊道地性的方法。
背景技术：
：杭白菊是菊科植物菊(chrysanthemummorifoliumramat.)的干燥头状花序，是最为著名的“浙八味”之一。菊药效成分主要是黄酮类、挥发油和绿原酸成分，性微寒，味苦，具有散风清热、平肝明目、清热解毒之功效。《神农本草经》记述杭白菊可“主诸风头眩、肿痛、目欲脱、皮肤死肌、恶风湿痹，久服利气，轻身耐劳延年”。现代药理学研究表明，杭白菊具有抗菌、抗氧化、清除体内自由基、降血脂、抗心血管疾病等功效。杭白菊除药用外，还以其色、香、味、形“四绝”而成为饮用佳品，是卫生部首批批准的药食同源的道地药材之一。杭白菊栽培历史悠久，主产于浙江桐乡，与亳菊、滁菊、贡菊并称为中国四大名菊。传统鉴别中药材的方法难以精准区分菊花与其混伪品。dna条形码技术在2003年被首次提出，并且迅速在物种的分类与鉴定研究领域中得到广泛的关注和应用。它是一种新型物种分子鉴定技术。该技术可以利用短的、标准的dna序列片段作为物种标记，定位亲缘关系，分析分支来源，为中药材提供快速、精准的鉴定。它弥补了传统鉴定方法的缺陷，并具有自身独特的优势，例如准确性高、稳定性好、操作简便等。由于核基因its2具有很强的物种水平鉴定能力和良好的pcr扩增效率，因此适合作为植物dna条形码的序列。its2区域可以潜在地用作标准dna条形码识别药用植物及其近缘种，并且可以作为一个新的通用条码来更广泛地识别植物类群。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种快速精准鉴定道地性杭白菊的检测方法，本发明采用高分辨率熔解曲线分析技术检测its2序列，分析熔解曲线特征及差异能够有效准确地鉴定浙江菊花(杭白菊)道地性。为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速精准鉴定道地性杭白菊的检测方法，包括dna提取，还包括以下内容：一、设置参数1)、pcr扩增pcr扩增体系为：反应成分浓度体积(μl)引物f(μl)10μm0.2引物r(μl)10μm0.2green-2-gomastermix2×5template*(dna)6～30ng/μl0.5rnasefreeh2otototalvolume10扩增体系中所用的its2的引物序列：引物f(its2-f)：atgcgatacttggtgtgaat；引物r(its3-r)：gacgcttctccagactacaat。pcr扩增程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为55～59℃(最佳退火温度为57℃)；green-2-gomastermix，即为green-2-goqpcrmastermix-lowrox(2x)；2)、将扩增产物直接进行hrm(即，上述40个循环后进入hrm程序)：hrm程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃；收集65～95℃的荧光信号数据。二、将杭白菊标准品(浙江道地性杭白菊)和待测样品分别按照步骤一所述参数进行hrm；以杭白菊标准品(浙江道地性杭白菊)为参照做基线，待测样品与基线所产生的相对荧光值的差值为纵坐标生成派生熔解曲线，从而获得高分辨率熔解曲线差异图；当待测样品与基线所产生的相对荧光值的差值为-1.756～1.244之间，判定是杭白菊(浙江道地性白菊花)；反之，则判定为非杭白菊。作为本发明技术方案的改进：高分辨率熔解曲线分析，是在rochellightcyclertm480ⅱ荧光定量pcr仪器上进行hrm。所采用的软件为lightcycler480ⅱ分析软件。当熔解曲线聚于基线，与基线差异值在-1.756～1.244之间，判定为杭白菊。安徽贡菊在tm值87.75℃和89.25℃出现正向偏离基线的双峰曲线，正向偏离基线高于5.744；河北菊花在tm值87.75℃和89.75℃出现正向偏离基线的双峰，同时在88.75℃出现负向偏离基线的单峰，正向偏离基线高于2.744，且反向偏离标准线低于-1.756。在本发明中，所用数据分析方法为hrm差异图分型法，直接对熔解曲线进行比较，通过软件归一化后，以荧光信号的差值建立曲线模型。作为本发明技术方案的改进：本发明利用磁珠法深加工产品基因组dna抽提试剂盒提取杭白菊药材干粉的dna，并进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度测定。所得dna浓度为265～687ng/ul。在本发明中，pcr扩增时，杭白菊包括其近缘种的pcr产物长度约400bp；pcr产物进行hrm分析时，以道地性杭白菊为参照做基线，与其他样品产生相对荧光值的差值为纵坐标生成派生熔解曲线，将其间差异放大，便于观察不同样品的差别，即，获得高分辨率熔解曲线差异图。在本发明中，还进行过如下的实验：取扩增产物20ul，用4.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5％ug/uleb)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。浙江道地性杭白菊与其他产地的菊花具有的条带均具有约400bp的条带。本发明在做高分辨率熔解曲线分析时发现不同产区菊花在直接获得的熔解峰图表现出的形状和出峰位置的差异不明显，以浙江道地性杭白菊为基线派生出的归一化熔解曲线将差异放大，获得了不同产地具有明显差异且同产地相聚类的曲线。本发明以建立its2序列高分辨率熔解曲线模型为基础进行物种鉴定，根据its2通用引物扩增获得pcr产物的实时熔解曲线形状及tm值差异区分物种。高分辨率熔解曲线分析：在rochelightcyclertm480ⅱ荧光定量pcr仪器上运行。本发明直接获得高分辨率熔解曲线分析，从而建立杭白菊及近缘物种典型归一化熔解曲线差异图曲线模型，根据参照基线及tm值差异所得导图来区分不同产地及不同种药材。综上所述，本发明采用的技术方案是：以菊花药材干品为材料，提取基因组dna，利用its2序列的通用引物进行荧光定量pcr扩增，利用高分辨率熔解曲线差异鉴定道地性杭白菊。扩增得到pcr产物，通过饱和染料对pcr产物的熔解曲线的实时变化的监测进行hrm测定，进行物种鉴定。本发明具有如下技术优势：1)、灵敏度高，hrm可区分单碱基突变，能够高灵敏度地鉴定基因多态性分型结果。2)、快速高效，hrm在几十分钟内即可完成反应，能够快速高效鉴定物种。3)、简单直观，根据产物不同tm熔解曲线形状，能够快速直观地鉴定物种。本发明首次建立杭白菊高分辨率熔解曲线模型，利用高分辨率熔解曲线技术针对杭白菊its2序列获得不同产区的曲线形状，与传统its2作为dna条码的测序分析方法比较，具有快速直观高效的优点。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为杭白菊及近缘物种鉴定的高分辨率熔解曲线图。a：杭白菊；b：安徽贡菊；c：河北祁菊；图2为浙江杭白菊及近缘物种pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测图。m：dnaladder；1-6：浙江杭白菊样品；7-8：河北祁菊；9-11：安徽贡菊样品。图3为退火温度50℃时pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测图。m：dnaladder；1-6：浙江杭白菊样品；7-8：河北祁菊；9-11：安徽贡菊样品。图4为退火温度60℃时pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测图；m：dnaladder；1-6：浙江杭白菊样品；7-8：河北祁菊；9-11：安徽贡菊样品。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1、一种浙江道地性杭白菊的鉴定方法，依次进行以下步骤：1)、dna提取：利用磁珠法深加工产品基因组dna抽提试剂盒提取菊花药材干粉的dna，并进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度测定。所得dna浓度为265～687ng/ul。利用rnasefreeh2o进行稀释，调整dna浓度为6ng/ul。2)、设置参数：以浙江菊花及其近缘物种的dna为模板进行pcr扩增后进入hrm程序：①、pcr扩增pcr扩增体系为：反应成分浓度体积(μl)引物f(μl)10μm0.2引物r(μl)10μm0.2green-2-gomastermix2×5template*(dna)6ng/ul0.5rnasefreeh2otototalvolume10pcr扩增程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，tm退火25s，72℃延伸30s；40个循环；引物退火温度为57℃；取扩增产物20ul，用4.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5％ug/uleb)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。如图2所示。在图2中，浙江道地性杭白菊与其他产地的菊花(安徽贡菊，河北祁菊)具有的条带均具有约400bp的条带，该条带的序列如seqidno：3所示。②、40个循环后进入hrm程序，即，将扩增产物直接进行hrm。hrm程序为：95℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降温至25℃。高分辨率熔解曲线分析：在rochelightcyclertm480ⅱ荧光定量pcr仪器上行hrm，收集65-95℃的荧光信号数据。使用lingcycler480ⅱ分析软件，以浙江道地性杭白菊为参照做基线，与其他样品产生相对荧光值的差值为纵坐标生成派生熔解曲线，将其间差异进行放大，从而获得高分辨率熔解曲线差异图。当待测样品与基线差异在-1.756～1.244之间，判定为杭白菊；反之，为非浙江道地性白菊花---杭白菊。结果为：当样品为浙江道地性杭白菊时，熔解曲线如图1的a所述。实验一、将事先已知是杭白菊的20个批次的待测品，已药检所杭白菊为标准品，按照实施例1所述方法进行检测，所得结果均为：其熔解曲线基线差异均为-1.756～1.244之间。实验二、将事先已知是杭白菊、安徽贡菊、河北祁菊的待测品(每类待测品均选用5个批次)按照实施例1所述方法进行检测，所得结果为：杭白菊，熔解曲线如图1的a所述线形，与基线差异在-1.756～1.244之间，判定为杭白菊；安徽贡菊，熔解曲线如图1的b所述峰形，贡菊在tm值87.75℃和89.25℃出现正向偏离基线的双峰曲线；正向偏离基线高于5.744；河北祁菊，熔解曲线如图1的c所述双峰形，tm值87.75℃和89.75℃出现正向偏离基线的双峰，同时在88.75出现负向偏离基线的单峰；正向偏离基线高于2.744，且反向偏离基线低于-1.756。对比例1-1、将实施例1中的退火温度由作为最佳温度的57℃改成50℃，其余同实施例1。所得结果为：pcr扩增效率较差，1号样品出现非特异性条带，1号和11号样品均未扩增出目的条带，2号样品扩增出400bp左右条带，但扩增产物浓度较低(图3)，不适于进行后续的hrm程序。对比例1-2、将实施例1中的退火温度由作为最佳温度的57℃改成60℃，其余同实施例1。所得结果为：除2、9、10号样品扩增出较淡条带外，其余样品均扩增失败(图4)。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。<110>浙江理工大学<120>浙江道地性杭白菊的鉴定方法<160>3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>its2-f<400>1atgcgatacttggtgtgaat20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>its3-r<400>2gacgcttctccagactacaat21<210>3<211>401<212>dna<213>菊花(chrysanthemummorifoliumramat.)<400>3ggccgagggcacgtctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgccccccacaattctccgtaa60agggaacatgtgttttgggggcggatattggtctcccgtgctcatggcgtggttggccga120aataggagtcctttcgatggacgcacgaactagtggtggtcgtaaaaaccctcgtctttt180gtttcgtgctgttgctcgcaaggtaaactctttaaaaaccccaatgtgccgtctcttgac240gacgcttcgaccgcgaccccaggtcaggcgggactacccgctgagtttaagcatatcaat300aagcggaggaaaagaaacttacaaggattcccttagtaacggcgagcgaaccgggaacag360cccagcttgaaaatcgggcggcttcgctgtccgaattgtag401当前第1页12