本发明涉及一种台湾别麻蝇dna条形码标准基因序列，用于该物种的快速准确鉴定。
背景技术：
：死亡时间(pmi)推断是刑事案件侦破的关键环节，腐败尸体pmi推断一直是法医学实践的难题。法医昆虫学是一门利用腐败尸体上的昆虫特别是蝇类的生长发育规律进行pmi推断的新型交叉型学科。在实际案件中,对腐败尸体中的嗜尸性昆虫进行种类鉴定后，然后结合该种类的发育资料，根据当地近期气温进行pmi推断，这对于案件的快速侦破至关重要，但不同种类昆虫在不同环境条件中的生长发育历期相差较大，因此快速准确地进行种类鉴定是关键因素。现场尸体上的成蝇产卵后常飞离尸体或不好采集，最常收集到的是大量的幼虫、蛹或蛹壳，甚至可能是一些残缺的昆虫肢体。而传统形态学鉴定的要点大都以成虫为基础，幼虫和蛹在形态学上种间非常相似,因此难以鉴别，为了进行种类鉴定只有先将现场尸体中收集的幼虫饲养至成蝇。与此同时，由于喂养的温度和湿度等环境因素及取食条件的变化，幼虫发育常受影响甚至死亡而难以鉴定其种类，从而阻碍案件的侦破。但近年来随着分子生物学的发展，针对处于不同时期、不同形态昆虫样本进行dna的提取，应用dna分子遗传标记进行种属鉴定的研究较为广泛，分子鉴定所涉及的序列种类和长度也逐渐多元化。但全序列分析费用高、耗时，而短片段序列信息量少、易出错、鉴别效力低，因此，急需寻找更为快速、准确、经济的dna遗传标记方法并能具体应用于实际案件的分析。目前我国已知嗜尸性蝇类有9科17个亚科49属105种，其中最常见的是丽蝇科(calliphoridae)、麻蝇科(sarcophagidae)和蝇科(muscidae)，而麻蝇因在pmi推断方面具有自身独特优势而颇受关注。但因我国地理位置跨度大，麻蝇种类的分布差异明显。台湾别麻蝇sarcophagaformosensis(kirneretlopes,1961)在我国目前已知分布仅辽宁，四川(雅安)，河北(张家口)，深圳石岩(羊台山)，贵州(贵阳)，广西，浙江，台湾(模拟产地)等地。近年来除陈禄仕(贵州)对该种类有少量研究外，几乎再无该蝇类的相关报道，因此本发明选取台湾别麻蝇作为研究对象，如能对该种类进行高效、准确地识别和鉴定，既有助于其在法医昆虫学中的具体应用，同时，收集dna数据，对完善基因库数据也显得尤为重要。目前，对台湾别麻蝇的鉴定仍依靠经验丰富的昆虫分类学家根据成虫的形态学特征来实现，其他虫态的鉴定也仍需饲养至成虫。dna条形码技术(dna-barcoding)是通过短的dna片段作为条形码来对物种进行快速、准确识别的技术。近几年来，该技术已被证明是一种较为有效的分子鉴定方法，既可与传统形态学鉴定方法作互为验证，又具有客观性和高效性，突破以往对经验的过度依赖，还可发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。因此理想的dna条形码应该符合以下几个标准:(1)种间有明显的遗传变异和分化，但种内又具有相对的保守性；(2)所选标准的dna片段应尽可能鉴定多种不同的物种类群；(3)目标dna区应当包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统(科、属等)中的位置；(4)存在高度保守区域，便于设计通用引物进行扩增；(5)目标dna片段足够短，便于dna提取和pcr扩增，尤其是对存在dna降解的样本(保存已久的干标本或者残缺样本等)。目前研究证明该技术在鸟类、鱼类、蚊类、蚁类、鳞翅目昆虫和双翅目等物种的分类鉴定中行之有效，因此，本发明将该技术应用于台湾别麻蝇的种类鉴定，该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决台湾别麻蝇不同虫态和残缺样本的种类鉴定问题，而且鉴定方法快速准确。目前，在美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)数据库中，尚无该种类coi基因中可作为条形码片段的相关记录。本发明提供的dna条形码标准基因序列，可以实现台湾别麻蝇种类的快速准确鉴定。后续实际应用中，对现场尸体中采集到的幼虫、蛹、蛹壳或成虫等提取dna后，应用相应引物进行扩增并测序，与本发明的barcode序列比对分析，即可根据序列的分支归属确定种类。这种方法的推广在保证物种鉴定准确性的同时，将能大大降低台湾别麻蝇在法医昆虫学中的应用难度。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种台湾别麻蝇dna条形码标准基因序列，实现台湾别麻蝇的快速准确鉴定。一种台湾别麻蝇dna条形码标准检测基因，其特征在于所述条形码标准检测基因为coi基因，具有如下所述的基因序列csuidno.1：所述的台湾别麻蝇dna条形码标准检测基因的pcr引物，其特征在于pcr引物序列为：f:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’r:5’-raaacttcaggrtgaccaaagaatca-3’本发明的台湾别麻蝇的分子鉴定方法，包括：1)对待测的台湾别麻蝇样本采用改良后的ctab法提取dna；2)以提取的dna为模板应用所设计引物进行pcr扩增，pcr的条件为：94℃预变性5min；94℃1min，51℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min；pcr的体系为：2×mastermix12.5μl，上下游引物各1μl，ddh2o8.5μl，模板2μl，共25μl；其中扩增引物：f:5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’，r:5’-raaacttcaggrtgaccaaagaatca-3’。3)取步骤2)的适量扩增产物应用1％琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯观察，根据扩增产物的条带大小判断为所需目的片段，然后进行测序；4)根据测序结果，与所述基因序列seqidno.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测标本为台湾别麻蝇。根据dna条形码技术原理，采用昆虫微量dna模板制备方法，通过改进的pcr反应条件，由合成的引物扩增台湾别麻蝇的coi基因，pcr产物送专业生物公司测序。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在genbank数据库中进行blast相似性比对，确保所得序列为目标序列。台湾别麻蝇的形态学鉴定有经验丰富的昆虫学者完成，确保种类鉴定的可靠性。所述引物根据文献改进(nelsonetal.,2007)，正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’，反向引物5’-raaacttcaggrtgaccaaagaatca-3’。本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列可用于台湾别麻蝇的种类鉴定，并保证准确、高效。附图说明图1为本发明的技术流程图。图2为本发明中台湾别麻蝇28个样本(包括一龄幼虫、三龄幼虫、蛹、蛹壳和成虫)的coi基因pcr扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1～5为实例1中一龄幼虫，6-8为为实例2中一龄幼虫，9-11为实例1中三龄幼虫，12-13为实例2中三龄幼虫，14-16为实例1中蛹，17-18为实例2中蛹，19-21为实例1中蛹壳，22-23为实例2中蛹壳，24-26为实例1中成虫，27-28为实例2中成虫(各样本的具体信息见表1)，检出大小为658bp的条带。m为2000plus的dnamarker。表1采样信息表样本编号测试虫态测试组织采集采集时间(年/月)采集虫态1一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08幼虫2一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08幼虫3一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08幼虫4一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08幼虫5一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08幼虫6一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08成虫7一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08成虫8一龄幼虫完整虫体贵阳2016/08成虫9三龄幼虫体内组织贵阳2016/08幼虫10三龄幼虫体内组织贵阳2016/08幼虫11三龄幼虫体内组织贵阳2016/08幼虫12三龄幼虫体内组织贵阳2016/08成虫13三龄幼虫体内组织贵阳2016/08成虫14蛹体内组织贵阳2016/08幼虫15蛹体内组织贵阳2016/08幼虫16蛹体内组织贵阳2016/08幼虫17蛹体内组织贵阳2016/08成虫18蛹体内组织贵阳2016/08成虫19蛹壳完整蛹壳贵阳2016/08幼虫20蛹壳完整蛹壳贵阳2016/08幼虫21蛹壳完整蛹壳贵阳2016/08幼虫22蛹壳完整蛹壳贵阳2016/08成虫23蛹壳完整蛹壳贵阳2016/08成虫24成虫胸肌贵阳2016/08幼虫25成虫胸肌贵阳2016/08幼虫26成虫胸肌贵阳2016/08幼虫27成虫胸肌贵阳2016/08成虫28成虫胸肌贵阳2016/08成虫具体实施方式实施例11、台湾别麻蝇标本的采集与保存野外动物尸体中采集幼虫，置于室内饲养至成虫，形态学鉴定为台湾别麻蝇。幼虫、蛹、蛹壳与成虫经冷冻处理后均置于密封塑料管中，75％酒精浸泡，-20℃保存。2、试验样品的前处理从上述保存的台湾别麻蝇样本中取出17只(一龄幼虫编号1-5，三龄幼虫编号9-11，蛹编号14-16，蛹壳编号19-21，成虫编号24-26)。将5只一龄幼虫先置于15ml的离心管内，加入超纯水浸泡，反复冲洗3次，放置于滤纸上晾干，然后将5只完整虫体分别移入ep管内；3只三龄幼虫的前期处理同上，晾干后，在体视镜下将胸部的肠道内容物及体壁移除，余组织分别移入ep管内；3只蛹的前期处理同上，晾干后在体视镜下取出蛹体内组织些许，分别移入ep管内；3只蛹壳的前期处理同上，晾干后直接移入ep管内；3只成虫前期处理同上，晾干后在体视镜下用镊子取下胸足，移入ep管中。以上17个样本均每管一只，并进行唯一编号，用于dna提取。其余部分仍继续保存以备进行验证。3、dna模板制备采用改良后的ctab法提取样品dna并于﹣20℃保存备用。4、引物合成本实施例1所用引物如下：正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’反向引物5’-raaacttcaggrtgaccaaagaatca-3’5、pcr扩增实施例1的pcr反应体系如表2所示。表2台湾别麻蝇coi基因pcr反应体系(25μl体系)成分体积(μl)模板2引物11引物212×mastermix12.5ddh2o8.5本实施例1的反应程序如表3所示。表3台湾别麻蝇coi基因pcr反应程序pcr产物于4℃保存备用。6、pcr扩增产物检测取4μlpcr扩增产物，用1％琼脂凝胶电泳(110v电压，电泳20min)。凝胶成像系统检测，各样本扩增产物的电泳图谱参见附图2。可以看出实施例1的17个样品均能特异性扩增出658bp左右的产物。7、基因序列测定将pcr扩增产物纯化后测序(测序引物与pcr所用引物相同)，取得基因序列经校正拼接后即为目的基因序列。鉴定结果的判断：测序结果显示17个样本与本发明的基因序列csuidno.1的同源性在99％以上，因而可以确认所述coi基因片段可以作为条形码用于台湾别麻蝇的种类鉴定。实施例21、台湾别麻蝇标本的采集与保存野外动物尸体中采集成虫，经形态学鉴定为台湾别麻蝇后置于室内饲养，幼虫、蛹及蛹壳为野外采集的成虫在室内饲养得到。幼虫、蛹、蛹壳与成虫经冷冻处理后均置于密封塑料管中，75％酒精浸泡，﹣20℃保存。2、试验样品的前处理从上述保存的台湾别麻蝇样本中共取11只(一龄幼虫编号6-8，三龄幼虫编号12-13，蛹编号17-18，蛹壳编号22-23，成虫编号27-28)。将3只一龄幼虫先置于15ml的离心管内，加入超纯水浸泡，反复冲洗3次，放置于滤纸上晾干，然后将3只完整虫体分别移入ep管内；2只三龄幼虫的前期处理同上，晾干后，在体视镜下将胸部的肠道内容物及体壁移除，余组织分别移入ep管内；2只蛹的前期处理同上，晾干后在体视镜下取出蛹体内组织些许后分别移入ep管内；2个蛹壳的前期处理同上，晾干后直接移入ep管内；2只成虫前期处理同上，晾干后在体视镜下用镊子取下部分胸肌组织，分别移入ep管中。以上11只样本均每管一只，并进行唯一编号，用于dna提取。其余部分仍继续保存以备进行验证。3、dna模板制备采用改良后的ctab法提取样品dna并于﹣20℃保存备用。4、引物合成本实施例1所用引物如下：正向引物5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’反向引物5’-raaacttcaggrtgaccaaagaatca-3’5、pcr扩增实施例1的pcr反应体系如表2所示。表2台湾别麻蝇coi基因pcr反应体系(25μl体系)成分体积(μl)模板2引物11引物212×mastermix12.5ddh2o8.5本实施例1的反应程序如表3所示。表3台湾别麻蝇coi基因pcr反应程序pcr产物于4℃保存备用。6、pcr扩增产物检测取4μlpcr扩增产物，用1％琼脂凝胶电泳(110v电压，电泳20min)。凝胶成像系统检测，各样本扩增产物的电泳图谱参见附图2。可以看出实施例2的11个样品均能特异性扩增出658bp左右的产物。7、基因序列测定将pcr扩增产物纯化后测序(测序引物与pcr所用引物相同)，取得基因序列经校正拼接后即为目的基因序列。鉴定结果的判断：测序结果显示11个样本与本发明的基因序列csuidno.1的同源性在99％以上，因而可以确认所述coi基因片段可以作为条形码用于台湾别麻蝇的种类鉴定。序列表<110>中南大学<120>一种台湾别麻蝇特异性dna基因序列<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>658<212>dna<213>台湾别麻蝇sarcophagaformosensis<400>1aactttatactttattttcggagcttgagcaggtatagtaggaacttcattaagaattct60tattcgagcagaattaggtcaccctggtgcattaattggagatgaccaaatttataacgt120aattgttacagctcatgcctttattataattttttttatagtaatgccaattataatcgg180aggatttggaaattgactggtaccaattatattaggagccccagatatagctttccctcg240aataaataatataagtttttgacttttacccccagcattaacactacttctagtaagcag300catagtagaaaatggagctggaacaggatgaactgtttaccctcctttatcttctaatat360tgcccatggaggtgcttctgttgatttagctatcttctcccttcatttagctggaatttc420atcaattttaggagcagtaaattttattactacagttattaatatacgatcttctggtat480tacatttgatcgaatgcctttatttgtatgatcagtagtaattacagctttacttttatt540actttctttacccgttcttgccggagcaattacaatattattaactgatcgaaatattaa600tacttcattttttgaccctgcaggaggaggagacccaattctataccaacatctattt658<210>2<211>25<212>dna<213>正向引物<400>2ggtcaacaaatcataaagatattgg25<210>3<211>26<212>dna<213>反向引物<400>3raaacttcaggrtgaccaaagaatca26当前第1页12