本发明属于鉴定鱼类多倍体的分子技术领域，具体涉及一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定引物及应用。
背景技术：
泥鳅(misgurnusanguillicaudatus)以其丰富的营养价值和特有的滋补药用功效而被誉为“水中人参”，深受中国、日本及韩国等地消费者的青睐。近年来，泥鳅的市场需求量日益增加，市场价格节节攀升，泥鳅养殖已经成为水产养殖者的新宠。
已有的细胞遗传学研究发现，我国的野生泥鳅群体中不仅有二倍体(2n＝50)，还存在大量的天然四倍体(4n＝100)。四倍体泥鳅的体型明显大于二倍体，具有显著的生长优势。进一步研究发现，这些四倍体泥鳅为同源四倍体，雌雄个体均可育，并能产出正常的二倍体配子。这种两性可育的天然四倍体泥鳅是我国特有的、非常珍贵的种质资源，为泥鳅优良品种的选育以及多倍体鱼类的细胞学、遗传学等方面的研究提供了理想的原材料。
然而，对二倍体和四倍体泥鳅的形态特征进行比较分析发现，两种倍性的泥鳅在外部形态上没有明显的区别，这给泥鳅倍性的区分，以及基于倍性的泥鳅种质资源利用、多倍体育种、遗传学研究等带来诸多不便。
目前常用的鱼类染色体倍性鉴定的方法主要包括形态学分析法、染色体计数法、红细胞核体积测量法以及流式细胞计数法等。其中，鉴别多倍体最准确、直接的方法是染色体计数法，但染色体计数法比较费时，而且获得良好的染色体标本并不容易，对实验者的技能和经验有较高的要求。此外，活体染色体检查需要将鱼杀死，利用组织培养进行染色体标本制备，步骤繁琐、效率低，不能为大规模鱼类倍性的鉴定所采用。红细胞核测量法取样简便，制片容易，也不需要昂贵的仪器设备，但bahmanietal.(2001)发现，鱼类红细胞核的大小会受到鱼类生活环境的影响，因此，采用红细胞核体积法鉴别多倍体鱼类时，一般需要用染色体计数法等加以矫正。人们在多倍体鱼类的研究工作中，很早就注意到了多倍体鱼类在形态特征方面所表现出来的差异性，并将其应用于鱼类的倍性分析。然而，本实验室在前期的研究中发现，二、四倍体泥鳅的形态特征非常相似，没有1个性状参数可以100％准确的区分出二倍体和四倍体泥鳅(周小云，2009)。近年来，流式细胞计数法以其准确、高效等特点而被科研工作者广泛采用。然而，流式细胞仪价格昂贵，且需要专门的技术人员操作。此外，上述方法均存在以下局限性：(1)只能对活体样本进行检测，对未经倍性鉴定的长期保存的实验鱼材料无法分析其倍性；(2)对于个体较小的样本无法进行取样分析。
基于微卫星多态性的鱼类倍性鉴定方法，是一种新的鱼类多倍体鉴定方法。该方法具有以下优势：(1)适用于各种类型的泥鳅样品，对某一待测样本，只需要取少量组织，提取基因组dna，便可鉴定出倍性，因此，该方法对活体样本、长期保存的样本以及个体较小的样本均适用；(2)检测步骤及仪器设备简便，该方法只涉及常规的dna提取、pcr扩增等，方法原理简单；此外，除实验室常规的仪器如pcr仪、离心机之外，不需要特别的仪器设备；(3)适用于大批量的样本检测，费用低。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定引物，本发明所开发的不同倍性泥鳅间的差异多态性引物准确率高、稳定性强，方法简便，只需要进行常规的pcr扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳即可完成对泥鳅体倍性的快速鉴定；所述的引物为：mats2-33f:caaactttagcagcaaaacgagt，r:tatgaaaatgttggtcacagtgc；mats3-48f:tttggtttgtttttgtgttgttg，r:aagtgacaaacggcaaatactgt；mats3-55f:tatccaacgcttcttcatttcat，r:tgtatccccatcacaagaaactt；mats4-65f:ttgtatagagagccatctgagcc，r:acaacacctcacctcttctgaac和mats4-75f:agcagcttgcagttcagtagaat，r:acgcacaaagacaccagagttta。
本发明的另一个目的在于提供一组基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定引物的应用，利用本发明提供的引物适用于各种类型泥鳅样本的倍性鉴定，包括长期保存的冻存样本、极小型样本等，可用于制备泥鳅倍性鉴定试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定引物，所述的引物如下：
一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定引物的应用，其应用步骤包括：
(1)提取待鉴定泥鳅样本的基因组dna；
(2)分别用上述5对引物对泥鳅样本的dna进行pcr扩增；
(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)统计利用各引物扩增得到的目的条带数目，并用quantityone软件分析各目的条带之间的定量值之比，确定条带类型，判定待测泥鳅的倍性。
判定方式为：如果5对引物扩增出后的凝胶电泳结果中出现ⅱ-tri或ⅲ-tri型条带中的一种或两种，则判定为三倍体；如果凝胶电泳检测结果中出现ⅱ-tetra，ⅲ-tetra或ⅳ-tetra型条带中的一种或两种或三种，则判定为四倍体；如果凝胶电泳检测结果中只出现ⅰ或ⅱ-di型条带中的一种或两种，则判定为二倍体。
以上条带类型的命名方式为：罗马字母代表条带数目，di表示各条带的定量值之比的和为2，tri表示各条带的定量值之比的和为3，tetra表示各条带的定量值之比的和为4。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次针对泥鳅，发明了一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定方法，弥补了现有的鱼类染色体倍性鉴定方法的不足，具有准确性高、方法简便、适合于各种类型泥鳅样本倍性鉴定等优势，为泥鳅的倍性区分，以及基于倍性的泥鳅种质资源利用、多倍体育种、遗传学研究等提供技术支撑。
附图说明
图1为利用本发明的5对引物对二、三、四倍体的泥鳅扩增后的凝胶电泳条带示意图；
泳道a～e为5对引物分别对二倍体泥鳅扩增后的凝胶电泳条带；泳道f～j为5对引物分别对三倍体泥鳅扩增后的凝胶电泳条带；泳道k～o为5对引物分别对四倍体泥鳅扩增后的凝胶电泳条带；
其中(a)：为二、三、四倍性泥鳅分别可能出现的微卫星条带类型；罗马字母代表条带的数目，di表示各表带的定量值之比的和为2，tri表示各条带的定量值之比的和为3，tetra表示各条带的定量值之比的和为4。
(b)为用quantityone软件分析得到的同一泳道中各目的条带间的定量值之比；
allel1,allel2,allel3,allel4分别表示(a)中自下而上的各个条带(等位基因)。
图2为实施例3中利用本发明的5对引物对部分二、三、四倍体泥鳅pcr后的带型分析示意图；
泳道1～5为二倍体泥鳅样本，6～10为三倍体泥鳅样本，11～15为四倍体泥鳅样本；
其中(a)为5对引物在二、三、四倍体泥鳅中的电泳结果；
(b)为同一泳道中不同目的条带间的定量值之比；allel1,allel2,allel3,allel4分别表示(a)中自下而上的各个条带(等位基因)。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定引物，所述的引物具体信息如表1所示：
表1基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定使用引物
实施例2：
一种基于微卫星多态性的泥鳅倍性鉴定方法
(1)取待测泥鳅的部分组织，用酚氯仿法提取基因组dna，用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量及完整性，用紫外分光光度计(nanodrop2000)检测dna的浓度；
(2)取少量dna稀释为100ng/μl的工作液备用，剩余dna于-20℃冰箱中保存；
(3)用实施例1中的5对引物(表1)分别对样品dna进行pcr扩增，扩增体系如表2所示：
表2.微卫星pcr扩增反应体系
(4)取5μl扩增产物，于7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(page胶)(配方如表3所示)中，150v电泳3h；
表3非变性聚丙烯酰胺胶配方
(5)用银染法对page胶进行显染色，将充分显色后的page胶置于光线充足处相机拍照或紫外凝胶成像系统中拍照，保存照片；
(6)根据预期目的片段的大小，比对puc18dna/msplmarkers，在page胶图上找到目的条带，统计同一个泳道中的目的条带数目；然后用quantityone软件对同一泳道中各目的条带进行定量分析，获得不同目的条带之间的定量值之比；结合目的条带的数目与各目的条带定量值之比确定条带类型。为了便于描述，本发明对二、三、四倍体泥鳅可能出现的条带类型进行命名，方法为“条带数目+定量值之比之和”。具体为，条带数目：只有1个目的条带命名为ⅰ型，有2个目的条带命名为ⅱ型，以此类推；定量值之比之和：比如在ⅱ型中，有两个目的条带，如果其定量值之比为1:1，则定量值之比之和为2，用di表示(二倍体英文diploid的简写)，该条带类型即为ⅱ-di型(如图1中(a)的d泳道,图1中(a)的e泳道)；如果两个目的条带的定量值之比为2:1，则定量值之比之和为3，用tri表示(三倍体英文triploid的简写)，该条带类型即为ⅱ-tri型(如图1中(a)的g泳道,图1中(a)的h泳道)；如果两个目的条带的定量值之比为3:1，则定量值之比之和为4，用tetra表示(四倍体英文tetraploid的简写)，该条带类型即为ⅱ-tetra型(如图1中(a)的l泳道)；
(7)根据5对引物扩增获得的条带类型确定待测泥鳅样本的倍性。方法为，如果5对引物扩增出的条带中出现ⅱ-tri或ⅲ-tri型条带中的一种或两种，则判定为三倍体；如果5对引物扩增出的条带中出现ⅱ-tetra，ⅲ-tetra或ⅳ-tetra型条带中一种或两种或三种，则判定为四倍体；如果5对引物扩增出的只有ⅰ或ⅱ-di型条带中的一种或两种，则判定为二倍体。
实施例3：
一种基于微卫星多态性的泥鳅染色体倍性鉴定引物的应用：
(1)收集野生泥鳅样本，流式细胞计数法鉴定倍性后，随机选取二倍体、三倍体和四倍体泥鳅各30尾，用于验证本发明技术方法的准确性；
(2)取待测泥鳅的部分组织，用酚氯仿法提取基因组dna，用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量及完整性，用紫外分光光度计(nanodrop2000)检测dna的浓度；
(3)取少量dna稀释为100ng/μl的工作液备用，剩余dna于-20℃冰箱中保存；
(4)用实施例1中的5对引物分别对各待测样本的dna进行pcr扩增，扩增体系如实施例2中表2所示，扩增程序为：94℃预变性5min，30个循环(94℃变性35s，退火35s，72℃延伸45s)，72℃后延伸8min，4℃保存；
(5)取5μl扩增产物，于7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(page)中(配方如实施例2中表3所示)，150v电泳3h；
(6)用银染法对page胶进行显染色，将充分显色后的page胶置于光线充足处相机拍照或紫外凝胶成像系统中拍照，保存照片；
(7)根据预期目的片段的大小，比对puc18dna/msplmarkers，在page胶图上找到目的条带，统计同一个泳道中的目的条带数目(图2中(a))；然后用quantityone软件对同一泳道中各目的条带进行定量分析，获得不同目的条带之间的定量值之比(图2中(b))；结合目的条带的数目及其定量值之比之和确定各样本在各引物中扩增的条带类型(方法如实施例2中第(6)步所释)，部分分析结果如表4所示；
(8)根据5对引物扩增获得的条带类型判定待测样本的倍性。如果5对引物扩增出的条带中出现ⅱ-tri或ⅲ-tri型条带中的一种或两种，则判定为三倍体；如果5对引物扩增出的条带中出现ⅱ-tetra，ⅲ-tetra或ⅳ-tetra型条带中一种或两种或三种，则判定为四倍体；如果5对引物扩增出的只有ⅰ或ⅱ-di型条带中的一种或两种，则判定为二倍体。
结果表明，根据微卫星条带类型判定的泥鳅倍性与流式细胞计数法鉴定得到的泥鳅倍性完全一致(表4)。
表4根据微卫星条带类型鉴定的泥鳅倍性结果
注：流式细胞计数法鉴定倍性后，表中1-5为二倍体泥鳅样本，6-10为三倍体泥鳅样本，11-15为四倍体泥鳅样本；根据微卫星条带类型判定的倍性结果与流式细胞计数法鉴定的结果完全一致。
sequencelisting
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