恩诺沙星‑钙螯合物及其合成方法和应用与流程

本发明涉及以恩诺沙星为配体的金属螯合物，具体涉及恩诺沙星-钙螯合物及其合成方法和应用。

背景技术：

喹诺酮类药物，即4-喹诺酮的衍生物，是一类重要的有机合成抗菌药物。按照母环结构，喹诺酮类药物可以分为萘啶酸类、吡哌酸类、喹啉酸类及氟嗪酸类。自1962年萘啶酸问世以来，喹诺酮类药物的发展十分迅速，已先后开发出四代药物，目前市场上主要应用的是其第三代药物和少量的第四代药物。喹诺酮类药物具有抗菌谱广、疗效高、不良反应少、生物利用度高、半衰期长等优点，在临床上应用广泛；但也面临着水溶性差及一定的毒副作用等缺点和不足，这在很大程度上又限制了其更好的临床应用。因此，开发新型高效、低毒、成药性更好的新型抗菌药物具有重要意义。

恩诺沙星，又名乙基环丙沙星、恩氟沙星，是一种动物临床上应用十分普遍的第三代氟喹诺酮类动物专用抗菌药物(即兽药)，疗效显著、广谱抗菌、价格低廉，因此市场占有率较高。恩诺沙星可通过口服和注射给药，均能吸收良好。恩诺沙星在临床应用上也存在不足：其水溶性差，几乎不溶于水，在常温下保存极易沉淀析出，严重影响了药品的出厂品质，对药剂的实际使用也造成很大不便。在兽医临床使用上，一般将其溶于碳酸钠溶液转变成钠盐后使用，此恩诺沙星钠盐的实测急性毒性ld50值为1421mg/kg，属于毒性三级(即低毒性药物)。综合上述恩诺沙星的优点和不足可见，以恩诺沙星为基础设计合成和开发新型动物专用抗菌药物是十分必要的。已有的应用研究仅着重于对其剂型的改进，更加具有创新性的新药研究与开发工作明显不足，亟待开展。

已有的研究表明，多种金属元素在生命体内发挥至关重要作用，被称为生命必需金属元素。在生物化学上，依据这些金属元素的毒性及其在生命体内的含量高低，分为宏量金属元素(如钙、钾、钠、镁等)和微量金属元素(如锰、铁、铜、锌等)，其中必需的微量金属元素在体内的含量有着严格限定，含量过高将会引起各种不良的生理/病理反应、甚至死亡。

近年来，恩诺沙星的金属配合物(即螯合物)(如铜、锌、稀土离子等)的合成及其药理活性研究已有陆续报道。在已有的恩诺沙星金属配合物的合成报道中，恩诺沙星一般先以无机碱(如naoh、koh、nahco3等)处理，脱去羧羟基上的氢，形成其钠盐或钾盐，再与重金属盐(多为氯化物、硝酸盐、醋酸盐，如cucl2等)配位反应生成目标配合物。但这种方法步骤繁琐，还会引入其它无机盐，导致无机盐残留，从而加重产品的分离提纯及后处理等工序。

另一方面，从已有报道可以看出，研究人员在对以恩诺沙星为配体的金属配合物研究中，均以重金属离子(如上述必需微量金属元素、有毒过渡金属元素等)作为其金属中心，而从未开展或在报道中表明试图开展以生命体必需的宏量金属元素(如钙、镁等)为中心的恩诺沙星金属配合物研究，这一领域目前尚属空白，这可能与本领域技术人员普遍认为钙、镁离子的配位能力较弱，其与恩诺沙星反应可能只生成相应的恩诺沙星金属盐有关。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种与恩诺沙星相比，水溶性提高、抗菌活性相当但毒性显著降低的恩诺沙星-钙螯合物及其合成方法和应用。

本发明所述的恩诺沙星-钙螯合物为具有下述式(i)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：

本发明所述的恩诺沙星-钙螯合物中，作为配体的恩诺沙星(即1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，英文名：enrofloxacin)，其分子式为c19h22fn3o3，分子量为359.40，其化学结构式如下式所示：

在配体恩诺沙星的分子结构中，3-羧羟基氧原子与4-羰基氧原子易于与钙离子螯合配位，形成3-羧羟基o与4-羰基o对钙离子的双齿螯合配位方式(以下所述的h-enro代表恩诺沙星，enro则代表恩诺沙星3-羧羟基脱质子后形成的螯合配体)。

本发明所述恩诺沙星-钙螯合物中的钙离子ca(ii)的配位数为8，enro配体与ca(ii)的物质的量之比为2：1。每个ca(ii)被两个羧羟基脱氢的enro分别通过3-羧羟基和4-酮羰基氧原子以双齿螯合方式配位，另有4个水分子与ca(ii)单齿配位，从而形成八配位金属配合物。本申请所述恩诺沙星-钙螯合物的配位结构式可表示为：[ca(enro)2(h2o)4]。

上述式(i)所示化合物的合成方法，主要包括以下步骤：由恩诺沙星(h-enro)和氢氧化钙(ca(oh)2)在极性溶剂中反应，制得目标物粗品；其中，所述的极性溶剂为水，或者是水与选自含1～3个碳原子的低碳醇(具体可以是甲醇、乙醇和丙醇等)中的一种或两种以上的组合，此时，水在极性溶剂中所占的比例为大于或等于10v/v％。

上述合成方法中，当极性溶剂为水与选自含1～3个碳原子的低碳醇中的一种或两种以上的组合时，进一步优选水在极性溶剂中所占的比例为大于或等于30v/v％，更优选水在极性溶剂中所占的比例为大于或等于50v/v％。

上述合成方法中，反应可以在加热或不加热的条件下进行，反应是否完全可采用薄层层析(tlc)跟踪检测。优选在加热条件下进行，这样可以进一步提高产率。进一步反应在30～100℃条件下进行，从节约能耗角度考虑，更优选反应在30～60℃条件下进行。当反应在30～60℃条件下进行、反应时间为1～12h时，所得产物的产率即可大于70％；也可根据需要适当延长反应的时间。

上述合成方法中，所述恩诺沙星与氢氧化钙物质的量之比理论上为2：1，但在实际合成时它们的摩尔比通常取为2：1～1.2。

上述合成方法中，所述极性溶剂的用量以能够溶解参加反应的原料为宜，通常情况下，以1mmol的ca(oh)2为基准计算，极性溶剂的用量一般为50～100ml。在具体的溶解步骤中，可先将ca(oh)2溶于极性溶剂中，再向其中逐渐加入h-enro，搅拌反应，生成产物；也可以先将h-enro加入到部分极性溶剂中形成混悬液，然后将氢氧化钙用水溶解后的溶液逐渐加入到混悬液中，充分搅拌反应以生成目标产物。

上述合成方法中，当前序步骤中极性溶剂的加入量特别是水的加入量较大(如接近配比的上限)或极性溶剂对产物的溶解性较好时，则反应后的反应液可能呈澄清状态，这是因为所形成的产物沉淀被极性溶剂溶解所致，此时可将反应液减压蒸馏以除去部分溶剂(除去极性溶剂加入量的75～90％)，使产物主要以沉淀形式析出，取出析出的沉淀进行洗涤(用水、乙醇等)、干燥后再得到目标物粗品。反之，当反应完成时，产物主要以沉淀形式存在于反应液中时，表明产物在反应溶剂中的溶解度较小，此时可将反应液直接过滤(或者进一步冷却后再过滤，以提高产率)，然后将滤饼进行洗涤(用水、乙醇等)、干燥，即得到目标物粗品。干燥通常在低温(室温～40℃)下完成，采用真空干燥或常压鼓风干燥。

由上述方法制得的是式(i)化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式(i)化合物的纯度。如采用重结晶来进行纯化，在将制得的目标物粗品进行重结晶时所用的试剂通常为乙醇。

本发明还包括上述式(i)化合物或其药学上可接受的盐在制备动物专用抗菌药物中的应用。

本发明进一步包括以上述式(i)化合物或其药学上可接受的盐为有效成分制备的动物专用抗菌药物。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、本发明所述恩诺沙星-钙螯合物较其配体恩诺沙星的水溶性明显提高：恩诺沙星基本不溶于水，需要制备成钠盐才能使其水溶性有所提高，但这会使其毒性显著增加；而本发明所得恩诺沙星-钙螯合物具有良好的水溶性，溶解度不低于0.2g/l。

2、本发明所述恩诺沙星-钙螯合物的抗菌活性与其配体恩诺沙星大体相当：申请人对本发明所述螯合物的体外抗菌活性测试结果表明，该螯合物对大肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏伤寒菌、金黄色葡萄球菌等菌种均有显著的生长抑制作用；在128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml的浓度下，其作用效果与恩诺沙星大体相同。

3、本发明所述恩诺沙星-钙螯合物的毒性较恩诺沙星钠盐或配体恩诺沙星显著降低：申请人就本发明所述螯合物对小鼠的体内急性毒性数据表明，本发明所述螯合物单次口服给药的半数致死量-ld50值为7736mg/kg，其急性毒性符合欧共体口服急性毒性初级标准和中华人民共和国食品安全性评价2级(实际无毒)标准，毒性大大低于恩诺沙星钠盐(ld50值为1421mg/kg为3级(低毒))，也明显低于恩诺沙星(ld50值为5312mg/kg为2级(实际无毒))，这表明本发明所述恩诺沙星-钙螯合物在保持恩诺沙星抗菌活性的基础上大大降低了其急性毒性，这有助于提高其作为兽药在安全剂量使用范围内的给药浓度和疗效。

4、虽然本发明所述恩诺沙星-钙螯合物发挥抗菌活性的物质基础仍主要依靠恩诺沙星，但是，在该螯合物中，钙离子通过配位作用改变了恩诺沙星在体内的运输和代谢动力学性质，从而有效降低了其体内毒性；反之，将恩诺沙星看作钙离子的载体，在体内释放出的钙离子也有助于促进动物生长和提高免疫力，达到合理有机补钙的目的。

5、本发明所述恩诺沙星-钙螯合物选择氢氧化钙作为钙源，因氢氧化钙可溶于水，在常温水溶液中即可一步完成对恩诺沙星的羧羟基脱氢和配位反应，简化了合成步骤，降低了生产成本；且反应产物只有目标配合物和水，无其它无机盐残留，进一步简化了产品的分离提纯和后处理工艺。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的最终产物的红外光谱谱图；

图2为本发明实施例1制得的最终产物的电喷雾质谱谱图；

图3为本发明实施例1制得的最终产物的单晶结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

取2mmol的h-enro溶于11ml水中，溶液呈混悬状；取1mmol的ca(oh)2溶于3ml水中，滴加到上述混悬水溶液中，60℃下水浴搅拌反应3小时，有大量沉淀生成。静置一晚，过滤，沉淀依次以少量冷水、乙醇洗涤，50℃下真空干燥1小时，得白色粉末；将滤液密封扎孔挥发几周，得白色片状晶体。将粉末和微晶经红外光谱、电喷雾质谱和x射线单晶衍射等进行结构测定，所得红外光谱谱图、电喷雾质谱谱图和晶体结构图分别如图1、图2和图3所示，确定为目标螯合物[caⁱⁱ(enro)2(h2o)4](产率：72％)。其中，

红外光谱的波谱数据为：(kbr,cm^-1):(-oh)3410.06(m),(ar-h)2811.69(m),(-nh)2966.29(m),(c＝o)1576.97(vs),(oc＝o)asym1623.96(vs),(oc＝o)sym1391.02(m),(c＝c)1486.59(s)；

质谱数据为esi-msm/z:360.3,[l+h]⁺,719.4,[2l+h]⁺,554.2,[l+ca+2dmso-h]⁺,757.3,[2l+ca-h]⁺；

对产物的元素分析结果为：anal(％).calcdfor[ca(enro)2(h2o)4]·h2o(c38h52caf2n6o11)(mw＝846.93):c53.84,h6.14,n9.92；found:c53.25,h6.04,n9.85。

实施例2

取2mmol的h-enro溶于90ml水中，溶液呈混悬状；取1mmol的ca(oh)2溶于10ml水中，滴加到上述混悬水溶液中，22℃下搅拌反应12小时。反应结束后，水溶液浑浊，有大量白色沉淀物析出。将反应液静置一晚后过滤，沉淀依次以少量冷水、乙醇洗涤，40℃真空干燥1小时，得到白色微晶，经红外光谱、电喷雾质谱对比进行结构测定，确定为目标螯合物[caⁱⁱ(enro)2(h2o)4](产率：70％)。

实施例3

取2mmol的h-enro溶于50ml水中，溶液呈混悬状；取1.2mmol的ca(oh)2溶于50ml丙醇中，滴加到上述混悬水溶液中，60℃下搅拌反应1小时。反应结束后，水溶液澄清，无明显沉淀析出。将反应液充分自然冷却静置一晚后有大量白色沉淀物析出。过滤，且沉淀依次以少量冷水、乙醇洗涤，40℃真空干燥1小时，得到白色微晶，经红外光谱、电喷雾质谱对比进行结构测定，确定为目标螯合物[caⁱⁱ(enro)2(h2o)4](产率：80％)。

实施例4

取2mmol的h-enro溶于90ml水/乙醇的混合溶剂中(其中水与乙醇的体积比为9：1)，呈混悬水溶液液；取1mmol的ca(oh)2溶于10ml水中，滴加到上述混悬水溶液中，55℃下回流反应2小时。反应结束后，水溶液澄清，静置一晚后，无沉淀物析出。再将反应液减压蒸发浓缩至约20ml以除去大部分溶剂，然后加入60ml水混合，充分冷却后静置析出大量白色沉淀。过滤，沉淀依次以少量冷水、冷乙醇洗涤，40℃下常压鼓风干燥6小时，得到白色微晶，经红外光谱、电喷雾质谱对比进行结构测定，确定为目标螯合物[caⁱⁱ(enro)2(h2o)4](产率：85％)。

实施例5

取2mmol的h-enro和1.1mmol的ca(oh)2溶于100ml水/甲醇的混合溶剂中(其中水与甲醇的体积比为1：2)，呈基本澄清状态，40℃下搅拌反应8小时，在搅拌过程中，溶液逐渐澄清，待反应结束后，仅有少量白色沉淀物析出。再将反应液减压蒸发浓缩至约20ml以除去大部分溶剂，然后加入60ml水混合，充分冷却后静置析出大量白色沉淀。过滤，将沉淀依次以少量冷水、冷乙醇洗涤，40℃下真空干燥2小时，得到白色微晶，经红外光谱、电喷雾质谱对比进行结构测定，确定为目标螯合物[caⁱⁱ(enro)2(h2o)4](产率：85％)。

实验例1：恩诺沙星配体和本发明实施例1制得的螯合物对5种人畜共患致病性细菌的体外抑菌实验

体外抑菌活性实验(抑菌圈实验)方法：

用纸片法做受试化合物的抑菌活性试验：取适量大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎链球菌分别接种于肉汤培养基，37℃培养18h后用麦氏管比浊法配成3×10⁸/ml的菌液，稀释为3×10⁵/ml的菌液，用灭菌棉签沾取菌液均匀地涂布于分好区的琼脂平皿上，将药敏纸片浸入药液中充分浸透后取出，去除纸片上多余的药液，纸片干燥后，将纸片贴在涂有细菌的培养基上。37℃的恒温箱中培养12～18h取出，用游标卡尺测量抑菌圈的大小，判断药物抑菌活性。表1列出了恩诺沙星及其6种代表性稀土金属螯合物的体外抑菌活性筛选结果：

表1：恩诺沙星及其钙螯合物对临床常见5种人畜共患致病性细菌的体外抑菌活性

注：1、化合物均溶解于水中配制成水溶液，进行抑菌活性测定；

2、表中数字指抑菌圈直径(φ)，以厘米(cm)为单位，同一浓度下，φ越大，表明药物的抗菌能力越强；

实验例2：恩诺沙星和本发明实施例1制得的恩诺沙星-钙螯合物的小鼠口服急毒实验

小鼠口服急性毒性实验方法如下：

选取20只20～22g健康昆明种小鼠，雌雄各半，随机分成2组。药物组按照不同剂量灌胃给药，对照组灌胃给予等量的生理盐水，一次性灌胃，连续观察7天。于第8天对小鼠称重后颈椎脱臼处死，立即取其肝脏、肾脏等内脏器官观察病理变化。再根据改良寇氏法计算半数致死量(ld50)。

毒性测试实验结果如下：

1、恩诺沙星(h-enro)：

恩诺沙星基本不溶于水，制成混悬液，测得其毒性剂量范围475～3560mg/kg，相邻两组剂量比r约为0.75。根据简化寇氏法计算正式实验结果后，求得h-enro的ld50为5312mg/kg，ld50可信限为3543～7954mg/kg。剂量组在给药后连续观察6h期间，部分小鼠相继出现倦卧呆立、蜷缩在一起、眼睑半睁开或闭合或流泪、眼球突出或充血、口吐唾液、运动失调、行走不稳、震颤挣扎、抽搐死亡、分泌物增多、会阴部污秽等症状。随后持续观察2周，每天进行一次一般性临床观察，其中给药后的第一天，低剂量组小鼠已经能够自由采食和饮食，精神状态良好、行为活动恢复正常，被毛较光亮，且其呼吸行为、体形大小均未见异常症状，同样眼睛、口鼻、会阴部均无异常分泌物或是出现红肿、溃烂等状态，粪便呈颗粒状、无死亡，而高剂量用药组小鼠较低剂量小鼠的一般临床症状要恶劣，一般临床表现比给药后6h观察到的有一定程度的好转。给药后第3-5天，几乎所有的km小鼠均能行动自如，恢复正常，摄食量和饮水量均升高，体重也有增长的趋势。

由于恩诺沙星基本不溶于水，动物临床上一般将其与等当量的碳酸钠混合，制成混悬液，即恩诺沙星钠盐。根据简化寇氏法计算正式实验结果后，求得恩诺沙星钠盐的ld50为1421mg/kg，ld50可信限为1137～1755mg/kg。给药后，给药组小鼠与空白小组无异，采食、饮水、披毛、排泄物、呼吸、行为运动等一切正常，其余6个剂量组部分小鼠在给药后相继出现了瘫卧蜷缩、四肢伸张、反应迟钝、呼吸过速过快、眼球突出充血、皮肤松弛、披毛蓬松、嘴唇水肿苍白、眼睑下垂、多只鼠扎堆紧凑在一角等临床症状；给药后6h内，高剂量组小鼠相继出现个别情况的兴奋挣扎后猝死，并伴随有眼神呆滞、口唇水肿、尿便严重失禁等现象；给药后第二天小鼠体重虽然没有增长趋势，但各方面都已开始渐渐恢复正常，且此后再无死亡情况发生。

结论：按中华人民共和国食品安全性评价标准2010版可知，恩诺沙星符合毒性2级标准，即为实际无毒化合物；恩诺沙星钠盐符合毒性3级标准，即为低毒化合物。

2、恩诺沙星-钙螯合物[caⁱⁱ(enro)2(h2o)4]：

经预实验，恩诺沙星-钙螯合物虽然较恩诺沙星水溶性有所提高，但溶解度并不大，因此实验时制成混悬液，测得其毒性剂量范围1800～5500mg/kg，相邻两组剂量比r约为0.75。根据简化寇氏法计算正式试验结果后，求得恩诺沙星-钙螯合物的ld50为7736mg/kg，ld50可信限为5275～11371mg/kg。小鼠死亡发生于给药后8～24小时之内，主要症状为精神沉郁、呕吐、背毛松乱无光泽、眯眼嗜睡。剖检死亡小鼠可见胃膨大、充满浅黄色液体、胃壁薄，达24小时死亡的小鼠肝、肾色淡，其余内脏器官无肉眼可见病理变化，并作病理切片观察脏器病变情况。

结论：按中华人民共和国食品安全性评价标准2010版可知，恩诺沙星-钙螯合物符合2级标准，即为实际无毒化合物，且其ld50值约为动物临床上使用的恩诺沙星钠盐的5.4倍、约为恩诺沙星的1.4倍，充分表明本文所述的恩诺沙星-钙螯合物毒性很低，临床应用预期较恩诺沙星具有显著优势。