体外重折叠波形蛋白的方法及其应用与流程

本申请大体涉及蛋白质工程领域，更具体而言，本申请涉及波形蛋白的制备方法，特别是体外重折叠波形蛋白的方法及其应用。

背景技术：

在类风湿性关节炎病人中已发现，波形蛋白含两个甘氨酸到精氨酸的突变，并且蛋白表面的精氨酸脱氨瓜氨酸化。用体外重组表达的瓜氨酸化突变型波形蛋白(mutantcitrullinatedvimentin，mcv)作为抗原来检测血清中抗体含量，是一种新的类风湿性关节炎检测方法，其灵敏度和特异性都比现有的类风湿性关节炎因子和环瓜氨酸肽临床检测方法高。

波形蛋白是细胞骨架中间丝家族成员之一。波形蛋白的完整三维结构迄今未知，虽然在pdb(proteindatabank)有多个已报道的波形蛋白片段结构(4ypc、4yv3、3g1e、3s4r、3ssu、3swk、3trt、3uf1、3klt)，但是最大片段也仅覆盖100多个氨基酸。异源表达的人波形蛋白及突变型波形蛋白可溶性差，需要体外变性后进行重折叠。然而，人波形蛋白及突变型波形蛋白的重折叠的体外条件目前报道的方法不明确。例如，已有报道使用层析法，用多组氨酸标记突变型波形蛋白，将其在变性条件下亲和层析结合在镍柱上，再用不含变性剂的含咪唑的缓冲液洗脱。但是，此方法的重复性较差，变性后的突变型波形蛋白无法洗脱，或洗脱后呈沉淀状态，明显未能正确折叠。此外，波形蛋白折叠后的蛋白构型尚无定性标准，折叠后易形成不同分子量大小的中间丝，无法准确定量用于后续的抗体含量检测。

因而，迫切需要建立正确折叠波形蛋白和/或质量控制的方法，以满足简便且低耗地诊断类风湿性关节炎的需求。

技术实现要素：

第一方面，本申请提供体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的方法，包括以下步骤：使重组表达获得的野生型或突变型波形蛋白制备物与ph为6-10的包含变性剂和还原剂的缓冲液接触以溶解所述制备物，并获得蛋白溶液；以及在氧化还原混合物存在下，通过透析法阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度，以重折叠野生型或突变型波形蛋白。

在一些实施方案中，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度包括通过透析法将所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中变性剂的浓度阶段性地降低至初始浓度的50％、25％和0％。在一些实施方案中，通过使用包含所述变性剂并且所述变性剂的浓度梯度降低的三种透析液，所述三种透析液中变性剂的浓度分别为所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中变性剂的浓度的50％、25％和0％。

在一些实施方案中，野生型或突变型波形蛋白制备物通过以下步骤获得：使宿主细胞表达野生型或突变型波形蛋白；裂解宿主细胞，获得包涵体形式的野生型或突变型波形蛋白制备物。

在一些实施方案中，变性剂为尿素和/或盐酸胍。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为1～10m。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为4～8m。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为8m。在该具体实施方案中，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度可以使用三种透析液依次实施透析，所述三种透析液中尿素和/或盐酸胍的浓度分别为4m、2m和0m。

在一些实施方案中，还原剂为二硫苏糖醇(dtt)或β巯基乙醇。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为1～20mm。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为5～15mm。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为10mm。

在一些实施方案中，氧化还原混合物为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些实施方案中，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例为1:10。

在一些实施方案中，缓冲液的ph为8，并且包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或盐酸胍。

在一些实施方案中，波形蛋白为人波形蛋白。

在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。在一些实施方案中，大肠杆菌表达由seqidno.2所示的dna序列编码的突变型波形蛋白。

第二方面，本申请提供用于体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的试剂盒，其包含ph为6-10、包含变性剂和还原剂的缓冲液，以及包含所述变性剂并且所述变性剂的浓度梯度降低的多种透析液。

在一些实施方案中，试剂盒还包含氧化还原混合物。

在一些实施方案中，变性剂为尿素和/或盐酸胍。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为1～10m。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为4～8m。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为8m。

在一些实施方案中，还原剂为二硫苏糖醇(dtt)。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为1～20mm。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为5～15mm。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为10mm。

在一些实施方案中，氧化还原混合物为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些实施方案中，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例为1:10。

在一些实施方案中，缓冲液的ph为8，包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或盐酸胍。在该具体实施方案中，试剂盒包含尿素或盐酸胍的浓度分别为4m、2m和0m的三种透析液。

第三方面，本申请提供鉴定正确重折叠的波形蛋白的方法，包括利用圆二色谱法检测波形蛋白样品，如果检测到α螺旋构型且不存在β折叠构型，则指示波形蛋白正确重折叠。

在一些实施方案中，圆二色谱法检测包括如下条件：在室温下，对波形蛋白样品进行180-600nm平面偏振光的扫描检测，检测左右旋圆偏振光的吸收系数差。

第四方面，本申请提供通过第一方面所述的方法制备的重折叠的突变型人波形蛋白。在一些实施方案中，所述突变型人波形蛋白相对于人野生型波形蛋白，在16和59位氨基酸残基突变为精氨酸。在一些实施方案中，利用seqidno:2所示编码序列产生所述突变型人波形蛋白。本申请还提供了seqidno:2所示编码突变型人波形蛋白的核酸分子。

第五方面，本申请提供通过第一方面所述的方法制备的重折叠的野生型或突变型波形蛋白在制备用于检测个体的生物样本中抗波形蛋白抗体的试剂中的用途。

本申请还提供用于检测个体的生物样本中抗波形蛋白抗体的试剂，其包含通过第一方面所述的方法制备的重折叠的野生型或突变型波形蛋白。

如上文所述，类风湿性关节炎患者的血液中含有突变型波形蛋白，其包含三处精氨酸突变，并且蛋白表面的精氨酸脱氨瓜氨酸化。因此，将通过第一方面所述方法获得的对应突变型波形蛋白在体外经多肽精氨酸脱氨酶处理而瓜氨酸化后，可用于检测血液或血清等组织液中人的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体含量，进而诊断类风湿性关节炎。

因此，本申请提供通过第一方面所述的方法制备的重折叠的突变型人波形蛋白(例如，相对于人野生型波形蛋白在16、59位突变为精氨酸)以及任选的精氨酸脱氨酶在制备用于检测个体的生物样本中抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂以及用于诊断类风湿性关节炎的试剂中的用途。

本申请还提供用于检测个体的生物样本中抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂或用于诊断类风湿性关节炎的试剂，其包含通过第一方面所述的方法制备的重折叠的突变型人波形蛋白(例如，相对于人野生型波形蛋白在16、59位突变为精氨酸)以及任选的精氨酸脱氨酶。

附图简要说明

图1示出所构建的表达突变型波形蛋白的质粒图谱。

图2示出已重折叠的突变型波形蛋白的圆二色谱谱图。

图3示出重折叠的突变型波形蛋白经多肽精氨酸脱氨酶处理前后的电泳结果，其中，泳道1为蛋白分子量标识；泳道2为1μg人突变型波形蛋白(g16/59r)+0.2μg多肽精氨酸脱氨酶(peptidylargininedeaminase,pad)，立即与sds上样缓冲液混合上样；泳道3为1μg人突变型波形蛋白(g16/59r)+0.2μgpad，55℃反应3个小时后再与sds上样缓冲液混合上样；泳道4和5分别为2与3双倍的蛋白上样。

图4显示了利用本申请的示例性瓜氨酸化突变型波形蛋白检测类风湿性关节炎患者和健康个体血清中抗瓜氨酸化突变型波形蛋白抗体的结果。

序列简要说明

seqidno:1显示了ncbi数据库中记录的野生型人波形蛋白的氨基酸序列。

seqidno:2显示了本申请的示例性突变波形蛋白的编码序列，其中人野生型波形蛋白的16和59位甘氨酸密码子被突变为精氨酸密码子，另外还进行了密码子优化等优化设计。

seqidno:3显示了本申请的示例性突变波形蛋白的氨基酸序列。

发明详细描述

除非另作说明，本申请所涉及的术语均按照相关领域普通技术人员的常规理解。

第一方面，本申请提供体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的方法，包括以下步骤：使重组表达获得的野生型或突变型波形蛋白制备物与ph为6-10的包含变性剂和还原剂的缓冲液接触以溶解所述制备物，并获得蛋白溶液；以及在氧化还原混合物存在下，通过透析法阶段式降低蛋白溶液中变性剂和还原剂的浓度，以重折叠野生型或突变型波形蛋白。

该方法适用于野生型/天然波形蛋白或者本领域已知的任何突变型波形蛋白的体外重折叠。

在一些实施方案中，突变型波形蛋白包括人天然波形蛋白中第16和第59位的甘氨酸突变为精氨酸。该突变体为类风湿性关节炎的一种血液标志物，因此通过本申请方法制备的重折叠的该突变体可用于检测个体的生物样本中由该突变体引发的抗体，进而诊断或辅助诊断类风湿性关节炎。

在一些实施方案中，野生型或突变型波形蛋白制备物通过以下步骤获得：使宿主细胞表达野生型或突变型波形蛋白；裂解宿主细胞，获得包涵体形式的野生型或突变型波形蛋白制备物。

在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。在一些实施方案中，大肠杆菌表达由seqidno.2所示的dna序列编码的突变型波形蛋白。在具体实施方案中，可以将野生型或突变型波形蛋白的编码序列置于强启动子(如t7或pbad等)控制下的质粒中，导入大肠杆菌，诱导表达后，野生型或突变型波形蛋白以不可溶的形式存在于包涵体内。

裂解宿主细胞的步骤可在下面描述的溶解步骤之前或同时进行细胞裂解。细胞裂解可通过例如机械剪切如法式压迫细胞(frenchpressurecell)、酶消化、超声处理、匀浆化、玻璃珠涡流、洗涤剂处理、有机溶剂、冻融、氧化铝或沙研磨、变性剂处理等等来完成。或者，可在二硫键还原剂或半胱氨酸阻断剂存在下裂解细胞。

上述方法包括使野生型或突变型波形蛋白制备物(例如，不可溶的包涵体形式)与包含变性剂和还原剂的缓冲液接触，以使其溶解。可使用如离心、过滤(包括超滤法)、沉淀、絮凝或固定等多种方法使不溶或聚集物质与可溶蛋白分离，以获得蛋白溶液。

在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液的ph为6～10。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液的ph为6～8。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液的ph为约8。

重折叠的目的在于获得蛋白的天然构象和天然二硫键。在本申请中，波形蛋白的重折叠是通过使蛋白溶液中变性剂的浓度通过透析法阶段式降低至足以允许蛋白复性为可溶生物活性形式的水平。

在一些实施方案中，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度包括通过透析法将所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中变性剂的浓度阶段性地降低至低于初始浓度的数个阶段直至0。作为非限制性的实例，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度可以包括将缓冲液中变性剂的浓度阶段性地降低至初始浓度的50％、25％和0％。作为非限制性的实例，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度可以通过使用包含对应于希望的各个阶段浓度的变性剂进行透析。在一些实施方案中，可以使用包含变性剂并且变性剂的浓度梯度降低的三种透析液，所述三种透析液中变性剂的浓度分别为包含变性剂和还原剂的缓冲液中变性剂的浓度的50％、25％和0％。

在透析液中添加氧化剂或氧化还原混合物能允许天然二硫键重建，从而促进重折叠。氧化剂的实例包括但不限于氧、胱氨酸、氧化型谷胱甘肽、胱胺和乙二硫醇酸。氧化还原混合物的实例包括但不限于半胱氨酸/氧、半胱氨酸/胱氨酸、半胱氨酸/胱胺、半胱胺/胱胺、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽等等。

在一些实施方案中，变性剂为尿素和/或盐酸胍。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为1～10m。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为4～8m。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为8m。在该具体实施方案中，阶段式降低蛋白溶液中变性剂的浓度可以使用三种透析液依次实施透析，所述三种透析液中尿素和/或盐酸胍的浓度分别为4m、2m和0m。

在一些实施方案中，还原剂为二硫苏糖醇(dtt)或β巯基乙醇。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为1～20mm。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为5～15mm。在一些实施方案中，包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇或β巯基乙醇的浓度为10mm。

在一些实施方案中，氧化还原混合物为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些实施方案中，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例为1:10。

在一些实施方案中，缓冲液的ph为8，并且包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或盐酸胍。

第二方面，本申请提供用于体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的试剂盒，其包含ph为6-10、包含变性剂和还原剂的缓冲液，以及包含所述变性剂并且所述变性剂的浓度梯度降低的多种透析液。

在一些实施方案中，试剂盒还包含氧化还原混合物。

在一些实施方案中，变性剂为尿素和/或盐酸胍。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为1～10m。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为4～8m。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中尿素和/或盐酸胍的浓度为8m。

在一些实施方案中，还原剂为二硫苏糖醇(dtt)。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为1～20mm。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为5～15mm。在一些实施方案中，所述包含变性剂和还原剂的缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为10mm。

在一些实施方案中，氧化还原混合物为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些实施方案中，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例为1:10。

在一些实施方案中，缓冲液的ph为8，包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或盐酸胍。在该具体实施方案中，试剂盒包含尿素或盐酸胍的浓度分别为4m、2m和0m的三种透析液。

第三方面，本申请提供鉴定正确重折叠的波形蛋白的方法，包括利用圆二色谱法检测波形蛋白样品，如果检测到α螺旋构型且不存在β折叠构型，则指示波形蛋白正确重折叠。

本申请发明人发现，在适当的盐浓度和ph条件下，波形蛋白形成低聚体形式而不会形成分子量大小不一的中间丝，并进而首次发现正确重折叠的波形蛋白的二级结构超过90％为α螺旋，例如如图2所示。因此，在一些实施方案中，如果检测到具有图2所示构型的圆二色谱结果，则指示波形蛋白正确重折叠。

在一些实施方案中，圆二色谱法检测包括如下条件：在室温下，对波形蛋白样品进行180-600nm平面偏振光的扫描检测，检测左右旋圆偏振光的吸收系数差。作为非限制性的实例，圆二色谱法检测包括如下条件：在室温下，对2mm光径的比色皿中0.08mg/ml的波形蛋白样品进行180-600nm平面偏振光的扫描检测，检测左右旋圆偏振光的吸收系数差。

第四方面，本申请提供通过第一方面所述的方法制备的重折叠的突变型人波形蛋白。在一些实施方案中，所述突变型人波形蛋白相对于人野生型波形蛋白，在16和59位氨基酸残基突变为精氨酸。在一些实施方案中，利用seqidno:2所示编码序列产生所述突变型人波形蛋白。本申请还提供了seqidno:2所示编码突变型人波形蛋白的核酸分子。seqidno.2所示的编码序列经过本申请发明人的优化，因而特别适于本申请的方法。

第五方面，本申请提供通过第一方面所述的方法制备的重折叠的野生型或突变型波形蛋白在制备用于检测个体的生物样本中抗波形蛋白抗体的试剂中的用途。

本申请还提供用于检测个体的生物样本中抗波形蛋白抗体的试剂，其包含通过第一方面所述的方法制备的重折叠的野生型或突变型波形蛋白。

如上文所述，类风湿性关节炎患者的血液中含有突变型波形蛋白，其包含三处精氨酸突变，并且蛋白表面的精氨酸脱氨瓜氨酸化。因此，将本申请所获得的突变型波形蛋白在体外经多肽精氨酸脱氨酶处理而瓜氨酸化后，可用于简便的检测血液或血清等组织液中人的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体含量，进而诊断类风湿性关节炎。

作为非限制性的实例，可以使用elisa酶联免疫反应(例如参见实施例)。但是应当理解，本申请提供的瓜氨酸化突变型波形蛋白也适用于其他免疫检测方法来检测血液或血清等组织液中人的抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体含量，包括比浊法、胶体金法、poct、荧光、化学发光标记法等。

因此，本申请提供了一种新的体外重折叠野生型或突变型波形蛋白的方法及其相应的试剂盒。通过该方法可以实现异源表达的突变型波形蛋白的体外正确重折叠，使得基于检测抗瓜氨酸化突变型波形蛋白抗体的类风湿性关节炎的诊断变得简便和低耗。

在一些实施方案中，可以使用多肽精氨酸脱氨酶pad处理本申请提供的重折叠的突变型波形蛋白。在一些实施方案中，pad和突变型波形蛋白的质量比1:5，在55℃反应3小时。由此获得的瓜氨酸化突变型波形蛋白经sds凝胶电泳进行质控检测显示蛋白精氨酸被瓜氨酸化，在凝胶电泳中迁移速率减慢。

在一些实施方案中，可以用本申请所提供的瓜氨酸化突变型波形蛋白进行微量滴定板板的包被。在一些具体实施方案中，包被后的平板与临床经ccp(环瓜氨酸化多肽)确诊的类风湿性关节炎病人和健康人的100倍稀释血清(100μl，实际使用1μl血清)共孵育20分钟，三次洗板后，用hrp(辣根过氧化物酶)偶联的抗人血清二抗共孵育20分钟，三次洗板后，用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(tmb)做底物进行免疫酶联反应。

实施例

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等的《分子克隆实验手册》(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或者按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1突变型波形蛋白基因的合成和质粒的构建

利用全基因合成的方式合成突变型波形蛋白，所构建的质粒图谱的示意图如图1所示。seqidno:1和3显示了野生型人波形蛋白和本申请的示例性突变波形蛋白氨基酸序列，其中seqidno:3与seqidno:1相比，人野生型波形蛋白的16和59位甘氨酸密码子被突变为精氨酸。

seqidno:1所示序列来自于波形蛋白(智人，染色体10,grch38.p2；nc_000010，基因ncbi登录号gi:578818565，蛋白登录号：p08670)。在引入突变密码子之外，还针对表达用宿主细胞大肠杆菌bl21(de3)对编码序列进行密码子优化，同时考虑以下因素：规避eagi、ecori、hindiii、kpni、ndei、ncoi、noti、saci、xbai、xhoi酶切位点，避免产生影响基因表达的二级结构，优化后的序列如seqidno:2所示。另外，为了便于纯化，在突变波形蛋白编码序列后添加了六个组氨酸标签的编码序列。由专业公司合成设计好的序列并装载入pet28a(+)载体上，组建表达单元：t7启动子-lac操纵子-mcv-his标签-t7终止子。

实施例2突变型波形蛋白的重折叠

将实施例1中所构建的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中。

经诱导表达后，大肠杆菌细胞用高压均质仪或超声法冻融法等方法破碎后，低速离心(3000g)去除未破碎细胞和细胞碎片，再经高速离心(14000g)，收获沉淀，即为包涵体——不可溶的突变型波形蛋白。

将包涵体溶解于ph为8.0、包含300mmnacl、10mmdtt、1mmedta、以及8m尿素的缓冲液中，室温下孵育10分钟，即可溶解包涵体。14000g离心去除沉淀，获得上清液。

利用透析法(基础透析液为100mm磷酸缓冲液，ph8.0，含氧化型和还原型的谷胱甘肽混合物(比例为1：10))阶段性降低上清液中尿素的浓度。透析过程分三个阶段进行，分别使用含4m、2m和0m的透析液进行。最后在含0m尿素的溶液中完成突变型波形蛋白的重折叠，获得含重折叠的突变型波形蛋白的磷酸缓冲液。

实施例3突变型波形蛋白重折叠构型的鉴定

将实施例2所获得的经重折叠的突变型波形蛋白的浓度调节为约0.2mg/ml，用圆二色谱法进行检测(在室温下，对2mm光径的比色皿中0.08mg/ml的波形蛋白样品进行180-600nm平面偏振光的扫描检测，检测左右旋圆偏振光的吸收系数差)，结果如图2所示。

由图2可见，突变型波形蛋白在208和222nm吸收系数差呈明显负值，在192nm吸收系数呈正值，表明经重折叠的突变型波形蛋白含α螺旋为主的二级结构，蛋白折叠后呈正确构型。

实施例4突变型波形蛋白与多肽精氨酸脱氨酶的作用

本实施例证实了由实施例2所获得的经重折叠后构型正确的突变型瓜氨酸化波形蛋白可与多肽精氨酸脱氨酶发生反应。

用实施例2所获得的突变型波形蛋白与多肽精氨酸脱氨酶(pad)反应，pad和突变型波形蛋白的质量比1:5，在55℃反应3小时(ph7.45mmcacl2溶液中)。随后将产物进行电泳(12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，200v80分钟，考马斯亮蓝染色、脱色)。

瓜氨酸化突变型波形蛋白在脱氨瓜氨酸化后由于与sds结合力的改变，在凝胶电泳中显示不同的迁移速率，具体如图3所示。由此获得的瓜氨酸化突变型波形蛋白经sds凝胶电泳进行质控检测显示蛋白精氨酸被瓜氨酸化，在凝胶电泳中迁移速率减慢。

实施例5瓜氨酸化突变型波形蛋白检测抗瓜氨酸化突变型波形蛋白抗体

用实施例4获得的瓜氨酸化突变型波形蛋白进行96孔板的包被，包被后的平板与临床经ccp(环瓜氨酸化多肽)确诊的类风湿性关节炎病人和健康人的100倍稀释血清(100μl，实际使用1μl血清)共孵育20分钟，三次洗板后，用hrp(辣根过氧化物酶)偶联的抗人血清二抗共孵育20分钟。三次洗板后，用3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(tmb)做底物进行免疫酶联反应。如图4所示，18个病人血清阳性率为100％，6个健康人也都呈现阴性结果。由此证实，根据本申请方法制备的瓜氨酸化突变型波形蛋白能有效用于检测类风湿性关节炎中的抗瓜氨酸化突变型波形蛋白抗体。

序列表

<110>深圳市倍诺博生物科技有限公司

<120>体外重折叠波形蛋白的方法及其应用

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465

<210>2

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<213>人工序列

<220>

<223>在野生型波形蛋白16和59位氨基酸残基引入精氨酸突变，并进行密码子优化

<400>2

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