专利名称：一种突变多角体蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种突变多角体蛋白，尤其涉及一种能够提高目的蛋白得率的的突变多角体蛋白及其制备方法。
背景技术：
由于多角体蛋白具有高效表达的能力，因此常将其作为一种标签，将不表达或者难表达的蛋白基因融合上去，从而使其表达或者提高其表达量。同时，可以利用多角体的溶解特性，通过简单的PH调节和差速离心的方法得到比较纯的融合蛋白，之后进行蛋白酶切得到纯的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用PH范围在7. 0-8. 5，而多角体蛋白只有在 ρΗΙΟ. 8时才会溶解，所以在这一条件下进行酶切时，蛋白酶丧失活性或者无法达到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。
发明内容
为了克服现有纯化方法中蛋白酶酶切效率较低的不足，本发明提供一种利用重叠延伸PCR方法得到的突变多角体蛋白。它有效地降低了多角体蛋白的溶解pH，使多角体蛋白在蛋白酶最佳酶切PH条件下处于溶解状态；在利用多角体蛋白作为标签纯化融合蛋白， 最后通过蛋白酶酶切方法将多角体去除时，蛋白酶就能发挥其最大活性，从而得到大量的目的蛋白。本发明解决问题所采用的技术方案是通过设计引物，将pET_28a载体上的所有蛋白标签去除，然后融合进去野生型多角体蛋白基因，目的是使得到的表达产物是不含任何标签蛋白的多角体蛋白。然后，设计含突变位点的引物，利用商品化的定点突变试剂盒， 将野生型多角体蛋白氨基酸序列中N端的4个连续的碱性氨基酸突变为酸性氨基酸，对这一连接有突变多角体蛋白基因的表达载体进行诱导表达后，通过传统的调节PH的方法进行纯化，并与野生型的多角体蛋白比较，检测到经突变的多角体蛋白在PH8. 5时就处于可溶状态。为达到上述目的，本发明提供一种突变多角体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。上述突变多角体蛋白的制备方法，包括以下步骤
(a)由PCR扩增的方法获得野生型多角体蛋白基因；
(b)通过设计引物，将pET-28a载体上的所有蛋白标签去除，并连接上步骤(a)所得到的多角体蛋白基因，构建成重组表达载体pET-28a-/70从；
(c)利用商品化的定点突变试剂盒，将野生型多角体蛋白氨基酸序列中N端4个连续的碱性氨基酸突变为酸性氨基酸，并设计含突变位点的引物；
(d)得到重组表达载体pETj8a-/70从后，利用商品化的定点突变试剂盒，通过步骤(c) 所得突变引物进行PCR扩增，获得完整的含突变位点的重组表达载体；
(e)将步骤(d)所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，获得所述突变多角体蛋白。进一步地，上述步骤(c)中将野生型多角体蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO 2所示)中的第32-35位4个连续的碱性氨基酸KRKK突变成了酸性氨基酸ESEE。进一步地，上述步骤(e)中得到的突变多角体蛋白在pH8. 5时能溶，而野生型多角体蛋白在PH10.8时能溶。本发明的有益效果是，一方面既能继续利用多角体作为蛋白标签来使不表达或者难表达的蛋白得以表达或者提高其表达量，另一方面在用蛋白酶将多角体蛋白切除时能使蛋白酶发挥其最大活性，得到大量的目的蛋白。
图1是本发明的pET-28a-/70从质粒图谱；
图2是本发明的pETj8a-/ o从重叠延伸PCR图；M :DNA Ladder Mix ； 1:PCR扩增条带； 图3是本发明的突变多角体蛋白表达图；M:蛋白分子量标准；1: pET-28a空载未诱导； 2: pET-28a 空载诱导；3: pET-28a-/ o7A 未诱导；4: pET-28a-/ o7A 诱导； 图4是本发明的突变多角体蛋白的pH调节M 蛋白分子量标准；1 :pH8. 5，4000rpm上清；2: ρΗ8· 5，4000rpm上清再次用15000rpm
离心后的上清。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。实施例1 引物设计
扩增野生型多角体基因，引物设计如下
上游引物 F 5，-CATGCr^r^CCAATTATTCATACACCC-3'(斜体表示 Afco I 酶切位点) 下游引物 R 5，-CQGGAr^ATACGCCGGACCAGTGAA-3'(斜体表示 BawR I 酶切位点)。实施例2 =PCR扩增野生型多角体基因(如SEQ ID NO=I所示)
以家蚕核型多角体病毒基因组(购自hvitrogen公司)，实施例1所得的上游引物F、 下游引物R为引物，扩增目的片段。PCR反应参数设计为，94°C预变性5min，94°C变性30s， 55°C退火30s，72°C复性延伸Imin, 30个循环，72°C延伸IOmin0在100 μ L的离心管中，加入下列组分 KOD Dash Buffer 5 μ L
2. 5mMdNTPs 1. 5μ L KOD Dash1 μ L
F1 μ L
R1 μ L
模板ι μ L
加无菌双蒸水至50 μ L。
各组分混勻后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。实施例3 突变引物的设计
根据前面所述的原则，将野生型多角体蛋白(如SEQ ID N0:2所示)的N端连续4个碱性氨基酸KRKK突变为4个连续的酸性氨基酸ESEE，用ft~imer5. 0设计的引物如下 上游引物 F，5，-GTGCTCCTCGCTCTCGGCGTTTTTGATAAG-3，
下游引物 R’ 5’ -GAGAGCGAGGAGCACCTAGTCGAACATGA -3’(粗体部分为突变位点)。实施例4 构建重组表达载体pET-28a-/70炀
实施例2得到的PCR产物经Afco I和汉3 H I双酶切后的基因片段克隆至经Afco I 和汉3 H I双酶切的载体pETj8aanVitrogen公司)中，使PCR扩增的基因连接到载体 pET-28a上，构建成重组表达载体pETj8a-/70从(见图1)，经酶切分析鉴定基因序列完全正确。实施例5 重组表达载体pET-28a-/70炀的突变
得到重组表达载体pETj8a-/7o从后，利用商品化的定点突变试剂盒(Transgene公司)，通过实施例3所得突变引物进行PCR扩增，得到完整的含突变位点的表达载体(其中含有突变多角体蛋白基因片段，如SEQ ID NO :3所示)，结果如图2所示。实施例6 突变多角体蛋白(如SEQ ID NO 4所示)的表达
含突变位点的重组表达载体经双酶切鉴定正确后，又经测序，证明其序列与设计的突变序列完全相同即突变成功。随后，将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(Invitr0gen公司) 进行诱导表达，4h后收集菌体，12000rpm离心lOmin，收集沉淀，加入50 μ L的1 XPBS重悬， 然后加入50 μ L的2Χ上样缓冲液进行样品制备，取15 μ L走12%的SDS-PAGE蛋白电泳， 并以空的表达载体作为对照，结果如图3所示，突变多角体蛋白(约^kDa)获得大量表达。实施例7 突变多角体蛋白的纯化
得到突变多角体蛋白后，利用传统的调节PH的方法进行纯化，并与野生型的多角体作对比，结果如图4所示，表明突变的多角体蛋白溶解性已发生变化，在ρΗ8. 5的上清中存在很大量，这是野生型多角体所不具备的。本发明的突变多角体蛋白基因连接目的蛋白基因后，得到的融合蛋白既能利用多角体的性质通过PH调节和差速离心的方法简化纯化步骤，又能在蛋白酶最佳作用ρΗ条件下进行酶切，得到最大量的目的蛋白，极大地提高了目的蛋白的得率。以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
权利要求
1.一种突变多角体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.—种权利要求1所述突变多角体蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(a)由PCR扩增的方法获得野生型多角体蛋白基因；(b)通过设计引物，将pET-28a载体上的所有蛋白标签去除，并连接步骤(a)所得到的多角体蛋白基因，构建成重组表达载体pET-28a-/70从；(c)利用商品化的定点突变试剂盒，将野生型多角体蛋白氨基酸序列中N端4个连续的碱性氨基酸突变为酸性氨基酸，设计含突变位点的引物；(d)得到重组表达载体pETj8a-/70从后，利用商品化的试剂盒，通过步骤(c)所得突变引物进行PCR扩增，获得完整的含突变位点的重组表达载体；(e)将步骤(d)所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，获得所述突变多角体蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中将野生型多角体蛋白氨基酸序列中的第32-35位4个连续的碱性氨基酸KRKK突变成了酸性氨基酸ESEE。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)中得到的突变多角体蛋白在 PH8. 5时能溶，而野生型多角体蛋白在ρΗΙΟ.8时能溶。
全文摘要
本发明涉及一种能够提高目的蛋白得率的突变多角体蛋白，属于生物技术领域。本发明主要通过构建重组表达载体pET-28a-polh，然后利用商品化的试剂盒对其进行突变得到完整的含突变位点的重组表达载体，再进行诱导表达，得到能够降低溶解pH的所述突变多角体蛋白。本发明的突变多角体蛋白基因连接上目的蛋白基因后，得到的融合蛋白既能利用多角体的性质通过pH调节和差速离心的方法简化纯化步骤，又能在蛋白酶最佳作用pH条件下进行酶切，得到最大量的目的蛋白，极大地提高了目的蛋白的得率。
文档编号C07K14/01GK102516369SQ20111043204
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者张耀洲, 杜君卿, 舒特俊, 陈剑清 申请人:天津耀宇生物技术有限公司