【技术领域】
本发明涉及饲料添加剂及其加工技术领域，特别涉及一种益生菌饲料添加剂。
背景技术：
益生菌被联合国粮农组织和世界卫生组织定义为一种具有生物活性的微生物，益生菌的种类繁多，大体上可以分成乳杆菌、双歧杆菌和革兰氏阳性球菌三大类。大量研究证实益生菌具有改预防和改善腹泻、促进肠道消化系统健康、增强免疫力、降低血清胆固醇、预防生殖系统感染等俱多作用。
近年来，大量使用抗生素作为饲料添加剂带来的弊端越来越明显，且造成的药物残留给人类和动物均带来了很大的影响。随着抗生素陆续被许多国家明令禁止使用，益生菌作为抗生素的替代品将会得到更好的发展。
微生物饲料添加剂是一种取代或平衡动物生态系统中一种或多种菌系的微生物制品。其作为饲料进入畜禽体内后，能迅速繁殖，促进畜禽肠道中形成乳酸菌的优势菌群，维持其肠道的微生态平衡，能有效促进畜禽的生长，降低饲料的消耗。目前，国内有很多关于益生菌应用在动物饲料上的报道：例如，中国专利cn106906145a公布的《一种用于发酵青贮饲料的益生菌剂及生产方法》该方法利用益生菌对青贮饲料进行发酵，达到减少动物消化系统疾病的目的，但是，发酵饲料仍存在制作工艺复杂、不方便储存、携带等问题，而且该方法也没有针对产奶水牛的身体特性进行研究，因此，生产一种工艺简单、方便携带、储存的饲料添加剂，以增加各微生物之间的协同作用，提高养殖效益，针对本地水牛奶身体情况提高水牛奶的饲养效率。
技术实现要素：
鉴于上述内容，有必要提供一种工艺简单、方便携带、储存的饲料添加剂，以增加各微生物之间的协同作用，提高养殖效益，针对本地水牛奶身体情况提高水牛奶的饲养效率。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种益生菌饲料添加剂，所述添加剂由每克活菌数为2.6×108cfu/g～9.3×108cfu/g的益生菌发酵制得，所述益生菌由格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌、嗜酒假丝酵母菌组成。
进一步的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12，保藏编号为cctccno:m2016469；所述皱褶假丝酵母菌为皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7，保藏编号为cctccm2016468；所述嗜酒假丝酵母菌为嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1，保藏编号为cctccm2016467；均从生鲜水牛乳中分离而得。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
(1)将格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌和嗜酒假丝酵母菌分别接种在mrs斜面培养基上进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，分别得到格氏乳球菌斜面培养菌、植物乳杆菌斜面培养菌、皱褶假丝酵母菌斜面培养菌和嗜酒假丝酵母菌斜面培养菌；
(2)将步骤(1)的格格氏乳球菌斜面培养菌、植物乳杆菌斜面培养菌、皱褶假丝酵母菌斜面培养菌和嗜酒假丝酵母菌斜面培养菌分别转接到装有灭菌好的mrs肉汤培养基试管中进行摇床培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到格氏乳球菌种子液、植物乳杆菌种子液、皱褶假丝酵母菌种子液和嗜酒假丝酵母菌种子液；
(3)将步骤(2)的格氏乳球菌种子液、植物乳杆菌种子液、皱褶假丝酵母菌种子液和嗜酒假丝酵母菌种子液按1：2:2:2的质量比进行混合得到混合种子液，然后按照混合种子液和发酵液的质量比为2:25的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，得到扩大后的种子菌液；
(4)将步骤(3)扩大后的种子菌液按种子菌液和发酵液的质量比为1-2:10的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，发酵的ph为3.2-4.8，冷却到室温得到混合菌种发酵液；
(5)将步骤(4)的混合菌种发酵液用转速为3000-8000rpm离心机进行离心，离心时间为15-20min，离心去掉上清液，得到半固体菌泥，将菌泥放在冰箱中冷冻4h后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，然后取出进行粉碎、装袋得到益生菌饲料添加剂。
进一步的，所述步骤(1)的mrs斜面培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉8.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.04g/l，琼脂14g/l，吐温-801g/l，余量为蒸馏水。
进一步的，所述步骤(2)的mrs肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，肉膏10.0g/l，酵母浸粉5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，半胱氨酸0.5g/l，吐温-801.0g/l，余量为蒸馏水，ph值为6.2-6.4。
进一步的，所述步骤(3)、(4)发酵底物的质量百分数为：水牛乳25％～41％，蔗糖5％～10％，酵母浸粉0.02％～0.14％、琼脂5％～8％、碳酸钙0.07％～1％、蒸馏水40％～60％。
进一步的，所述步骤(4)的混合菌种发酵液中植物乳杆菌含活菌数为2.6×108～5.3×108cfu/g，格氏乳球菌含活菌数为3.1×108～3.8×108cfu/g。
进一步的，所述益生菌饲料添加剂应用于奶水牛养殖。
本申请的益生菌饲料添加剂中微生物菌种来源如下：
1、本申请的植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12：
上述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12自水牛乳中分离而得，水牛乳取自广西水牛研究所种水牛场，采用mrs培养基平板涂布法、斜面划线法分离而得，16srdna菌种鉴定由生工生物工程(上海)公司完成。细菌生理生化实验利用法国梅里埃公司的api20a试剂条完成。菌种适合生长温度为37～39℃，于2016年9月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016469。
2、本申请的皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7：
上述皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7从水牛乳中分离而得，水牛乳取自广西水牛研究所种水牛场，采用mrs培养基平板涂布法、斜面划线法分离而得，16srdna菌种鉴定由生工生物工程(上海)公司完成。细菌生理生化实验利用法国梅里埃公司的api50ch试剂条完成。菌种适合生长温度为30～35℃，于2016年9月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016468。
3、本申请的嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1：
上述嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1从水牛乳中分离而得，水牛乳取自广西水牛研究所种水牛场，采用mrs培养基平板涂布法、斜面划线法分离而得，16srdna菌种鉴定由生工生物工程(上海)公司完成。细菌生理生化实验利用法国梅里埃公司的api50ch试剂条完成。菌种适合生长温度为30～35℃，于2016年9月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016467
4、本申请的格氏乳球菌：
上述格氏乳球菌通过市售得到，从中国典型培养物保藏中心购买。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明饲料添加剂所使用的益生菌是从本地水牛奶的新鲜乳液中分离、纯化、培养而得的，比市售的微生物益生菌对水牛身体更具有特异性，能有效提高益生菌的对水牛身体的调控，能显著改善动物肠道微生物菌群，提高免疫力，可减少抗生素类药物的使用，消除药物残留，应用于生产，能缩短饲养周期，节省饲料，从而提高养殖收入。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
经过实验表明，本申请的格氏乳球菌(简称：格氏)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12(简称：y12)、皱褶假丝酵母菌为皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7(简称：y7)、嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1(简称：y1)的生理生化实验结果如表1所示：
表1
由此得出，格氏乳球菌、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12、皱褶假丝酵母菌为皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7、嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1的培养条件，如实施例1-3所示：
实施例1：
一种益生菌饲料添加剂，所述添加剂由每克活菌数为2.6×108cfu/g的益生菌发酵制得，所述益生菌由格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌、嗜酒假丝酵母菌组成。
上述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12，保藏编号为cctccno:m2016469；所述皱褶假丝酵母菌为皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7，保藏编号为cctccm2016468；所述嗜酒假丝酵母菌为嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1，保藏编号为cctccm2016467；均从生鲜水牛乳中分离而得。
本实施例还提供一种用于制备益生菌饲料添加剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌和嗜酒假丝酵母菌分别接种在mrs斜面培养基上进行培养，其中，mrs斜面培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉8.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.04g/l，琼脂14g/l，吐温-801g/l，余量为蒸馏水，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，分别得到格氏乳球菌斜面培养菌和植物乳杆菌斜面培养菌；
(2)将步骤(1)的格格氏乳球菌斜面培养菌、植物乳杆菌斜面培养菌、皱褶假丝酵母菌斜面培养菌和嗜酒假丝酵母菌斜面培养菌分别转接到装有灭菌好的mrs肉汤培养基试管中进行摇床培养，其中，mrs肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，肉膏10.0g/l，酵母浸粉5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，半胱氨酸0.5g/l，吐温-801.0g/l，余量为蒸馏水，ph值为6.2，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到格氏乳球菌种子液和植物乳杆菌种子液；
(3)将步骤(2)的格氏乳球菌种子液、植物乳杆菌种子液、皱褶假丝酵母菌种子液和嗜酒假丝酵母菌种子液按1：2:2:2的质量比进行混合得到混合种子液，然后按照混合种子液和发酵液的质量比为2:25的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，其中，发酵底物的质量百分数为：水牛乳30％，蔗糖5％，酵母浸粉0.02％、琼脂5％、碳酸钙0.07％、蒸馏水59.91％，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，得到扩大后的种子菌液；
(4)将步骤(3)扩大后的种子菌液按种子菌液和发酵液的质量比为1.5:10的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，其中，发酵底物的质量百分数为：水牛乳40％，蔗糖10％，酵母浸粉0.14％、琼脂8％、碳酸钙1％、蒸馏水40.86，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，发酵的ph为3.2，冷却到室温得到混合菌种发酵液，其中，混合菌种发酵液中植物乳杆菌含活菌数为2.6×108，格氏乳球菌含活菌数为3.1×108；
(5)将步骤(4)的混合菌种发酵液用转速为3000离心机进行离心，离心时间为15min，离心去掉上清液，得到半固体菌泥，将菌泥放在冰箱中冷冻4h后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，然后取出进行粉碎、装袋得到益生菌饲料添加剂。
本实施例的饲料添加剂适用于奶水牛养殖。
实施例2：
一种益生菌饲料添加剂，所述添加剂由每克活菌数为9.3×108cfu/g的益生菌发酵制得，所述益生菌由格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌、嗜酒假丝酵母菌组成。
上述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12，保藏编号为cctccno:m2016469；所述皱褶假丝酵母菌为皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7，保藏编号为cctccm2016468；所述嗜酒假丝酵母菌为嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1，保藏编号为cctccm2016467；均从生鲜水牛乳中分离而得。
本实施例还提供一种用于制备益生菌饲料添加剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌和嗜酒假丝酵母菌分别接种在mrs斜面培养基上进行培养，其中，mrs斜面培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉8.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.04g/l，琼脂14g/l，吐温-801g/l，余量为蒸馏水，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，分别得到格氏乳球菌斜面培养菌和植物乳杆菌斜面培养菌；
(2)将步骤(1)的格格氏乳球菌斜面培养菌、植物乳杆菌斜面培养菌、皱褶假丝酵母菌斜面培养菌和嗜酒假丝酵母菌斜面培养菌分别转接到装有灭菌好的mrs肉汤培养基试管中进行摇床培养，其中，mrs肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，肉膏10.0g/l，酵母浸粉5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，半胱氨酸0.5g/l，吐温-801.0g/l，余量为蒸馏水，ph值为6.4，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到格氏乳球菌种子液和植物乳杆菌种子液；
(3)将步骤(2)的格氏乳球菌种子液、植物乳杆菌种子液、皱褶假丝酵母菌种子液和嗜酒假丝酵母菌种子液按1：2:2:2的质量比进行混合得到混合种子液，然后按照混合种子液和发酵液的质量比为2:25的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，其中，发酵底物的质量百分数为：水牛乳29.91％，蔗糖5％，酵母浸粉0.02％、琼脂5％、碳酸钙0.07％、蒸馏水60％，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，得到扩大后的种子菌液；
(4)将步骤(3)扩大后的种子菌液按种子菌液和发酵液的质量比为2:10的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，其中，发酵底物的质量百分数为：水牛乳40.86％，蔗糖10％，酵母浸粉0.14％、琼脂8％、碳酸钙1％、蒸馏水40％，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，发酵的ph为3.2-4.8，冷却到室温得到混合菌种发酵液，其中，混合菌种发酵液中植物乳杆菌含活菌数为5.3×108cfu/g，格氏乳球菌含活菌数为3.8×108cfu/g；
(5)将步骤(4)的混合菌种发酵液用转速为8000rpm离心机进行离心，离心时间为20min，离心去掉上清液，得到半固体菌泥，将菌泥放在冰箱中冷冻4h后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，然后取出进行粉碎、装袋得到益生菌饲料添加剂。
本实施例的饲料添加剂适用于奶水牛养殖。
实施例3：
一种益生菌饲料添加剂，所述添加剂由每克活菌数为6.3×108cfu/g的益生菌发酵制得，所述益生菌由格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌、嗜酒假丝酵母菌组成。
上述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12，保藏编号为cctccno:m2016469；所述皱褶假丝酵母菌为皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7，保藏编号为cctccm2016468；所述嗜酒假丝酵母菌为嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1，保藏编号为cctccm2016467；均从生鲜水牛乳中分离而得。
本实施例还提供一种用于制备益生菌饲料添加剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将格氏乳球菌、植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌和嗜酒假丝酵母菌分别接种在mrs斜面培养基上进行培养，其中，mrs斜面培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉8.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.04g/l，琼脂14g/l，吐温-801g/l，余量为蒸馏水，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，分别得到格氏乳球菌斜面培养菌和植物乳杆菌斜面培养菌；
(2)将步骤(1)的格格氏乳球菌斜面培养菌、植物乳杆菌斜面培养菌、皱褶假丝酵母菌斜面培养菌和嗜酒假丝酵母菌斜面培养菌分别转接到装有灭菌好的mrs肉汤培养基试管中进行摇床培养，其中，mrs肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/l，肉膏10.0g/l，酵母浸粉5.0g/l，葡萄糖20.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，半胱氨酸0.5g/l，吐温-801.0g/l，余量为蒸馏水，ph值为6.3，培养温度为37℃，培养时间为24h，分别得到格氏乳球菌种子液和植物乳杆菌种子液；
(3)将步骤(2)的格氏乳球菌种子液、植物乳杆菌种子液、皱褶假丝酵母菌种子液和嗜酒假丝酵母菌种子液按1：2:2:2的质量比进行混合得到混合种子液，然后按照混合种子液和发酵液的质量比为2:25的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，其中，发酵底物的质量百分数为：水牛乳40％，蔗糖8％，酵母浸粉0.12％、琼脂7％、碳酸钙0.08％、蒸馏水44.8％，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，得到扩大后的种子菌液；
(4)将步骤(3)扩大后的种子菌液按种子菌液和发酵液的质量比为1:10的接种量接种到装有发酵底物的发酵罐中，其中，发酵底物的质量百分数为：水牛乳25％，蔗糖9％，酵母浸粉0.10％、琼脂6％、碳酸钙0.9％、蒸馏水59％，发酵温度为37℃，发酵时间为24h，发酵的ph为4.1，冷却到室温得到混合菌种发酵液，其中，混合菌种发酵液中植物乳杆菌含活菌数为4.3×108cfu/g，格氏乳球菌含活菌数为3.5×108cfu/g；
(5)将步骤(4)的混合菌种发酵液用转速为5000rpm离心机进行离心，离心时间为17min，离心去掉上清液，得到半固体菌泥，将菌泥放在冰箱中冷冻4h后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，然后取出进行粉碎、装袋得到益生菌饲料添加剂。
本实施例的饲料添加剂适用于奶水牛养殖。
照组1：
其它制备方法、配方与实施例1完全相同，但是用市售的em菌液替代本申请的益生菌发酵剂。
对照组2：
其它制备方法、配方与实施例1完全相同，但是用市售的植物乳杆菌、皱褶假丝酵母菌、嗜酒假丝酵母菌替代本申请的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)y12，皱褶假丝酵母(candidarugosa)y7，嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)y1。
喂养实验：
广西水牛研究所种牛场，试验设计：试验时间为2015年10月7日至2015年12月7日，本试验采取随机配对原则，试验牛为三品杂奶水牛(本地水牛×尼里﹣拉菲水牛×摩拉水牛)将60头奶水牛，随机分为实验组和对照组，每组10头奶水牛，按照如下的饲养配方进行喂养实验：
实验组1：向4kg的基础日粮中添加20g实施例1的益生菌饲料添加剂；
实验组2：向4kg的基础日粮中添加20g实施例2的益生菌饲料添加剂；
实验组3：向4kg的基础日粮中添加20g实施例3的益生菌饲料添加剂；
实验组4：向4kg的基础日粮中添加20g对照组1的益生菌饲料添加剂；
实验组5：向4kg的基础日粮中添加20g对照组2的益生菌饲料添加剂；
对照组：基础日粮
饲喂10天后，计算各组奶水牛的粪便干物质增加量；饲喂30天后，计算各组的产奶量；饲喂60天后，计算各组的日平均增重量；观察奶水牛的外观并记录，具体实验结果见表2：：粪便干物质增加量计算公式：
产奶量计算公式：
日平均增重量计算公式：
表2
由上表可知，实验组1-3的干物质增加量明显低于实验组4-5和对照组，产奶增加量明显高于实验组4-5和对照组，日平均增重明显高于试验组4-5和对照组；腹泻发病率明显低于实验组4-5和对照组；说明，使用本申请的方法制备饲料添加剂可明显提高奶牛的产奶量、日平均增重、粪便的干物质含量降低，能提高对有效物质的应用；同时腹泻发病率降低，能有效改善肠道。
综上所述，使用本申请的方法生产饲料添加剂能能显著改善动物肠道微生物菌群，提高免疫力，可减少抗生素类药物的使用，消除药物残留，应用于生产，能缩短饲养周期，节省饲料，从而提高养殖收入。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。