一种厌氧菌培养装置及培养方法与流程

本发明涉及一种专门用于培养厌氧菌的装置和方法，尤其是涉及一种用苛氧菌进行厌氧培养的装置及方法。

背景技术：

厌氧菌(anaerobicbacteria)是指一类需要生长在低氧或无氧条件下的微生物，因为厌氧微生物没有完整的代谢酶系，故以无氧发酵的方式进行能量代谢，其生存需在较低的氧化还原电势条件下才能进行。动物体内的一些低氧化还原电势的组织为厌氧菌的生长繁殖提供了有利条件。厌氧菌的研究一直是临床医学的重心。厌氧菌可进入血液引起菌血症、败血症等，严重威胁病人生命。近10年来研究证明，无芽胞厌氧杆菌及球菌是细菌性感染的重要原因之一，当深部脓肿、败血症等常规细菌学检查阴性时，往往源于厌氧菌感染.厌氧菌感染是一种内源性感染，病原菌遍及临床各科，人体的各个部位，各种器官均可发生厌氧菌感染，据文献报道，10％的菌血症可检出厌氧菌，牙源性口面部感染病例中有94％，吸入脚市炎及肺脓肿时有93％，妇产科各种感染性疾病中有100％，直肠周围脓肿有77％可检出厌氧菌，而且有相当一部分病例是单一的厌氧菌感染。

同时，厌氧菌是研究微观生态平衡、失调和调整的重要部分，在消化道菌群中，99％以上为厌氧菌，它们组成了重要的消化菌群，并在生物拮抗、营养、免疫等方面具有不可估量的意义。另外，以消化道菌群为研究对象的微生态学已取得了大量科研成果，厌氧微生物的分离、培养、筛选，有利于发现更多有益功能的微生物，丰富微生物菌种质资源，有利于人类进一步揭示厌氧微生物与宿主营养、免疫和健康这间的关系。目前，国内外在医学、食品和饲料领域等众多科研和企业对此领域产生了浓厚兴趣。这些研究都说明了厌氧菌的研究对于人或经济物种的疾病防治具有重大意义。

目前常见的厌氧分离培养方法常采用琼脂稀释振荡法(agarshakedilutionmethod)、亨盖特滚管技术(hungateroll-tubetechnique)、厌氧罐(anaerobicjar)或厌氧袋(bio-bag)培养法、厌氧手套操作箱。近几年，有些学者将应用于好氧培养的高通量分选技术应用到厌氧培养。

琼脂稀释振荡法是将菌液进行浓度梯度稀释后注入50℃左右的无氧液态琼脂培养基试管中，振荡使混匀，待培养基凝固之后，加入石蜡密封，培养一段时间后可在琼脂柱内部或试管内壁长出肉眼可辨菌落。该方法的缺点在于由于有的菌落会生长在凝固的琼脂中，所以不利于观察菌落形态，也给单菌落的挑取带来不便。

亨盖特滚管技术是美国著名的微生物学家hungate在1950年发明，后经不断改进，目前应用也较多。其原理是利用高温加热的铜柱消耗空气中的氧气反应来获得高纯氮气培养环境，并在培养基配制和分装过程中使用高纯氮气驱逐空气。从培养基的配制到菌种的接种及培养等过程都在高度无氧条件下，从而保证严格厌氧菌的存活。该方法是将菌液进行浓度梯度稀释后注入50℃左右的无氧液态琼脂培养基中，然后用滚管机滚管或将试管水平放置于冰块中迅速滚动，使含有菌的培养基在试管内壁上凝固成一层匀质的琼脂膜。该技术与琼脂稀释振荡法相比，克服了前者难以观察单菌落的缺点，但单菌落的挑取仍然不容易进行，操作繁琐，技术要求较高。

厌氧袋是一种塑料材质、透明而不透气的可密封的袋子，装入培养皿后，再放入产气袋，使袋内氧气被消耗。也可抽真空/充氮气反复进行2-3次以排除袋内氧气。厌氧袋轻便易操作，是广受推崇的厌氧培养容器。但该方法厌氧袋容量小，且已破损漏气，使得环境很不恒定，培养批次不够均一。

厌氧罐法是把培养物放进罐中，然后抽气/充气(氮气或混合气体，含氢气)，其内部的氧气和氢气在催化剂的作用下反应生成水，从而清除了内部少量的氧气。厌氧手套操作箱的出现，使厌氧菌的研究得到了发展，尤其是培养、研究严格厌氧菌，其解决了长久以来使用厌氧罐或厌氧袋无法进行厌氧操作的问题，使厌氧培养实现了类似好氧培养的过程。该仪器采用抽真空充氮气的方法以排除实验操作过程中带入的大部分氧气。随后真空/充氮的技术渐渐显现出不足之处。最大的缺点在于每次操作过程中样品或实验用品放入箱内时，都要反复进行抽气/充氮，过程繁复且耗费大量气体；真空泵磨损也会使维护成本升高。后来，有人针对这些缺陷对厌氧手套箱进行了技术升级。实现了无真空充氮操作，利用钯的催化作用将厌氧操作箱内的氧气与混合在氮气中的氢气催化生成水，以耗尽厌氧手套操作箱内部的氧气。但是需要使用的氢气给厌氧手套操作箱的使用带来了一定的安全隐患。厌氧手套操作箱经过多年的改良和设计，除了运行成本高等问题，是目前做厌氧研究最为便利有效的仪器。

自动氧净厌氧培养皿(oxyplatetm)是由美国oxyrase公司首次研发并投入生产。该培养皿专为厌氧培养设计，其内含有特定的酶系，可以消除培养或操作过程中带入的氧气，并可以持续很长时间，十分利于厌氧培养。但目前oxyplatetm由于制作成本高，所以价格昂贵，国内较少采用，多在临床医学上采用以分离厌氧致病菌，难以广泛应用。

分离嗜热厌氧菌的高通量法是hamilton-brehm等在2012年借助功能强大的流式细胞仪和96孔板实现对嗜热厌氧菌高通量筛选及培养方法，其培养环节在厌氧手套操作箱中进行。该方法的优点是实现了厌氧培养的高通量，缺点是利用流式细胞仪进行筛选的过程是在好氧的环境中进行的，不利于分离严格厌氧菌；流式细胞仪及厌氧手套操作箱都是昂贵的大型仪器，且维护费用高。

海藻酸钙微球包埋法是brner等在2013年发明的一种厌氧菌培养方法。其利用海藻酸盐制备微球的过程中将单个微生物细胞包埋进微球中，然后置于培养基中培养，微生物细胞通过微球摄取培养基的养分。整个过程需在厌氧手套操作箱中进行，也可实现高通量。该方法与上述分离嗜热厌氧菌的高通量法相比，优点在于整个包埋、培养过程都可在厌氧操作箱中进行，利于分离严格厌氧菌和生长较慢的菌。缺点也是需要流式细胞仪的分选，仪器昂贵，维护繁琐。

以上几种方法都存在自身难以克服的缺陷，或操作繁琐，或设备昂贵，操作繁琐，耗时耗材，或形成绝对无氧环境需要较长时间，或容易漏气而使营造的无氧环境难以长久维持等。由于这些特点，有关厌氧菌的试验研究工作，就难免受到种种技术条件的限制，不易达到目的。因此，设计一种价格低廉，方法简便，不需催化剂的简单实用的厌氧菌培养装置就十分必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种结构简单，操作方法简便，经济实用，适宜广泛推广，不仅能给临床提供直接、有效、经济的诊断指标，而且可提高厌氧菌的阳性检出率的新型厌氧菌培养装置。

本发明的另一目的在于提供一种培养出的厌氧菌阳性率高，结果可靠，方法简单，适合各类微生物实验室的厌氧菌培养，简单易学，便于普及推广的新型厌氧菌培养的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种厌氧菌培养装置，由钢制罐体1以及钢制盖体2组成，所述的钢制罐体1与所述的钢制盖体2通过螺纹紧密连接；

所述的钢制盖体2的顶部设有提手10、出气阀门8以及氧气和温度显示器9，钢制盖体2的内部设有温度传感器探头7以及氧气检测探头11，温度传感器探头7以及氧气检测探头11与氧气和温度显示器9相连；

所述的钢制罐体1的内部从下到上依次设置有1个储液器皿3、1-3个培养皿搁板4、1个试管搁板6以及一个试管架5；所述的储液器皿3用于盛装亚硫酸钠溶液；所述的培养皿搁板4用于放置培养皿；所述的试管架5上设置有多个孔，用于放入并固定试管；所述的试管搁板6用于承托试管；所述的储液器皿3、培养皿搁板4、试管搁板6以及试管架5的边缘由一个矩形框架12连接，拿出框架的同时可将储液器皿3、培养皿搁板4、试管搁板6以及试管架5一并拿出；所述的钢制罐体1的下部设有进气阀门13。

在本发明中，优选的，所述的钢制盖体2的内部顶部设有硅胶垫，所述钢制罐体1的罐口上边缘设有硅胶垫，以保证盖与管体螺纹盖紧时起到进一步密封的作用，已达到整个管体在使用时的气密性。

在本发明中，优选的，所述的储液器皿3的材质为玻璃或树脂。

在本发明中，优选的，所述的培养皿搁板4的材质为钢制或铝合金。

在本发明中，优选的，所述的试管搁板6以及试管架5的材质为铝合金、树脂或塑料。

在本发明中，优选的，所述的矩形框架12的材质为钢制或铝合金。

进一步的，本发明还提出了一种使用所述的厌氧菌培养装置培养厌氧菌的方法，包括如下步骤：

(1)制备培养标本，即将拟厌氧培养的培养菌，接种到含有固体培养基的培养皿中或含有液体培养基的试管中；

(2)迅速配制2mol/l的亚硫酸钠溶液加入储液器皿内，将步骤(1)制备的标本样品放置到培养层，固体培养基标本放置在培养皿搁板上，液体培养基标本放置在试管架上；

(3)将钢制盖体与钢制罐体通过螺纹拧紧密封，拧紧进气阀门，打开出气阀门，将真空泵软管安装在出气阀门的出气口，并启动真空泵，将培养罐子内气体抽出至罐内压力为200mmhg；然后将氮气管道安装于进气阀门，将氮气平衡至760mmhg，打开出气阀门，将氮气排出，如此抽气-充气反复数次，残留的氧气由亚硫酸钠溶液清除，观察氧气和温度显示器，当氧气浓度小于1％时进行厌氧菌培养；

(4)将厌氧菌培养罐放置在37℃培养箱中进行厌氧培养，并定期观察培养罐温度和氧气浓度，若发现氧气浓度不达标时，应马上进行抽气，并充入氮气，使培养罐氧气浓度始终处于低氧或无氧的状态。

其中，优选的，所述的抽气-充气次数在5次以上，即可使容器内气体浓度接近通入气的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明仅使用一钢制培养罐附带适宜的培养装置和廉价的耗氧试剂(亚硫酸钠)，即可创造低氧或无氧的厌氧菌培养环境。同时，本发明设置o2和温度检测装置，可以做到对罐体内培养环境实时监测，可以保障厌氧菌培养良好培养环境。因此，其具备价格低廉，简便实用，厌氧培养环境可控，无需催化剂的简单实用的特点。

附图说明

图1为本发明的厌氧菌培养装置的结构示意图。

图中：1-钢制罐体；2-钢制盖体；3-储液器皿；4-培养皿搁板；5-试管架；6-试管搁板；7-温度传感器探头；8-出气阀门；9-氧气和温度显示器；10-提手；11-氧气检测探头；12-矩形框架；13-进气阀门；14-培养皿；15-试管。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对厌氧菌培养装置及培养方法做进一步详细说明。

如图1所示一种厌氧菌培养装置，包括：钢制罐体1、钢制盖体2、储液器皿3、培养皿搁板4、试管架5、试管搁板6、温度传感器探头7、出气阀门8、氧气和温度显示器9、提手10、氧气检测探头11、钢制矩形框架12、进气阀门13。

本发明的厌氧菌培养装置由钢制罐体1以及钢制盖体2组成，所述的钢制罐体1与所述的钢制盖体2通过螺纹紧密连接，钢制盖体2的内部顶部设有硅胶垫，钢制罐体1的罐口上边缘设有硅胶垫，以达到钢制盖体2与钢制罐体1通过螺纹紧密连接时起到进一步密封的作用，保证整个罐体在使用时的气密性；钢制盖体2的顶部设有提手10、出气阀门8以及氧气和温度显示器9，钢制盖体2的内部设有温度传感器探头7以及氧气检测探头11，温度传感器探头7以及氧气检测探头11与氧气和温度显示器9相连；钢制罐体1的内部从下到上依次设置有1个玻璃或树脂材质的储液器皿3，厌氧菌培养时在储液器皿3内现配浓度为2mol/l的亚硫酸钠溶液，钢制或铝合金材质的2个培养皿搁板4，铝合金、树脂或塑料材质的1个试管搁板6以及一个试管架5；所述的培养皿搁板4用于放置培养皿14；所述的试管架5上设置有多个孔，用于放入并固定试管15；所述的试管搁板6用于承托试管15；所述的储液器皿3、培养皿搁板4、试管搁板6以及试管架5的边缘由一个钢制矩形框架12连接，通过该框架使得罐体内部成为一个整体，拿出框架的同时可将储液器皿3、培养皿搁板4、试管搁板6以及试管架5一并拿出，可以很方便的加入取样剂，放置预培养器皿；钢制罐体1的下部设有进气阀门13。

使用所述的厌氧菌培养装置培养厌氧菌的方法，包括如下步骤：

(1)制备培养标本，即将拟厌氧培养的培养菌，接种到含有固体培养基的培养皿中或含有液体培养基的试管中；

(2)迅速配制2mol/l的亚硫酸钠溶液加入储液器皿内，将步骤(1)制备的标本样品放置到培养层，固体培养基标本放置在培养皿搁板上，液体培养基标本放置在试管架上；

(3)将钢制盖体与钢制罐体通过螺纹拧紧密封，拧紧进气阀门，打开出气阀门，将真空泵软管安装在出气阀门的出气口，并启动真空泵，将培养罐子内气体抽出至罐内压力为200mmhg；然后将氮气管道安装于进气阀门，将氮气平衡至760mmhg，打开出气阀门，将氮气排出，如此抽气-充气反复数次，残留的氧气由亚硫酸钠溶液清除，观察氧气和温度显示器，当氧气浓度小于1％时进行厌氧菌培养；

(4)将厌氧菌培养罐放置在37℃培养箱中进行厌氧培养，并定期观察培养罐温度和氧气浓度，若发现氧气浓度不达标时，应马上进行抽气，并充入氮气，使培养罐氧气浓度始终处于低氧或无氧的状态。

其中，所述的抽气-充气次数在5次以上，即可使容器内气体浓度接近通入气的浓度。

实施例1、产气荚膜梭菌分离培养

1.1病料采集

采集表现典型下泻症状鸡的直肠内容物；对病情严重或濒死鸡则扑杀后剖检，取小肠黏膜和内容物。

样品采集后标记并迅速装入冰盒，如果不能当天带回实验室处理则放入冰箱保存，运输过程要保证冰盒里温度够低，适宜放入些冰袋。

1.2细菌分离与纯化

1.2.1增菌培养

取0.1～0.2g样品放入已灭菌的含有ft液体培养基的试管内。迅速配制2mol/l的亚硫酸钠溶液加入储液器皿3内，将上接种病料的含有ft液体培养基的试管插入试管架5的孔洞中，底部与下方的试管搁板6接触。将钢制盖体2盖到钢制罐体1上并拧紧，拧紧进气阀门13，打开出气阀门8，将真空泵软管安装在出气阀门13的出气口，并启动真空泵，将罐体内气体抽出至罐内压力为200mmhg。然后将氮气管道安装于进气阀门13，将氮气平衡至760mmhg，打开出气阀门8，将氮气排出，如此抽气-充气反复数次(在实际应用中，若抽气-充气次数≥5，即可使容器内气体浓度接近通入气的浓度)，残留的氧气由亚硫酸钠溶液清除。观察o2和温度显示器9，使o2浓度小于1％即可进行厌氧菌培养。将经过上述步骤处理的样品及厌氧菌培养罐放置在37℃培养箱中进行厌氧培养并定期观察o2和温度显示器9。若发现o2浓度不达标时，应马上进行抽气，并充入氮气。使培养罐内o2浓度始终处于低氧或无氧的状态。

1.2.2纯化培养

将上接种病料的ft液体培养基的试管，37℃培养18h。增菌培养后，每个样品分别稀释至10^-2、10^-3和10^-4，取每个稀释梯度200μl于tsc(含卵黄)平板上，用三角玻璃棒涂布均匀，将平板放入厌氧培养罐中的平面培养层上后，重复1.2.1抽负压、充气的步骤，以达到厌氧菌培养所需要求。37℃培养18h后，挑取周围有乳白色浑浊晕环的疑似菌落，因产气荚膜梭菌分解卵黄中的卵磷脂导致在含有卵黄的琼脂平板上菌落周围会出现乳白色浑浊圈。在tsc(不含卵黄)平板上用三线法划板，在厌氧培养装置培养18h，再挑取菌落中心为黑色的菌落，反复纯化培养2-3次。将中心为黑色的单菌落接种于装有ft液体培养基的试管中，重复1.2.1步骤，即可得到产气荚膜梭菌纯培养物。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域技术人员理解，在不脱离权利要求限定的精神和范围的情况下，可作出许多修改、变化或等效，但都将落入发明的保护范围之内。