一种海带多糖‑铬配合物的制备方法及其应用与流程

本发明属于医药领域，具体涉及一种海带多糖-铬配合物的制备方法及其应用。

背景技术：

铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素,三价铬参与糖代谢,是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素,它除了具有降低血糖外，还具有较强的提高免疫和抗应激作用。通常动物补铬是采用无机铬盐制剂,但却不能达到所期待的效果。

海带及藻类多糖也具有增强免疫、抗肿瘤作用。海洋蕴含着生物种类的80%以上，是生物多样性的巨大储存库，海带是一种分布较广、营养价值较高的食用藻类，且我国海带资源丰富。研究表明，海带多糖(bsp)对正常及免疫低下小鼠免疫功能的具有显著影响。bsp经腹腔注射给药后,测定了各组小鼠胸腺、脾指数,外周血白细胞数,脾的t、b细胞增殖能力,脾细胞产生il-2能力,以及血清和脾细胞溶血素含量等的变化。结果bsp100mg/(kg·d)×10d能显著提高免疫低下小鼠胸腺、脾指数及外周血白细胞数,还能提高正常小鼠胸腺、脾指数；明显促进正常及免疫低下小鼠脾的t、b细胞增殖能力和脾细胞产生il-2能力；bsp还能增加正常及免疫低下小鼠血清和脾细胞溶血素的含量。结论：bsp是一种免疫调节剂,对正常及免疫低下小鼠的免疫功能具有促进作用。

有机配体与金属离子形成螯合物后其性能将发生较大变化，它不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，并赋予其高生物利用率等特殊性能。可能还具有其他的功能，很多的抗癌药物、抗生素与金属螯合以及多糖铁的合成应用也证明了这一点。鉴于此，如果将海带多糖与金属离子螯合，其性能也必将发生很大的改善。由于多糖有丰富的羟基，是很好的配体，而铬有空3d轨道是很好的中心离子，只要条件合适必将形成稳定的螯合物。本项目拟用海带多糖与铬螯合形成海带多糖-铬螯合物，研究其提高免疫力的效果，为开发新型高效、安全、不良反应小的免疫增强剂奠定基础，为充分开发和利用海带资源提供借鉴。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种海带多糖-铬配合物的制备方法及其应用。

本发明所述的海带多糖-铬配合物是将海带粗多糖通过酶解法与svage法进行去蛋白提纯，将提纯后的海带多糖在不同的温度、不同的ph值、不同的反应时间与cr³⁺自组装反应获得海带多糖-铬配合物。经红外光谱仪检测，海带多糖与铬配位形成络合物。动物活性实验表明，海带多糖-铬配合物能提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力,因而可用于制备抗衰老、免疫调节剂的药物和保健食品。

本发明所述的海带多糖-铬配合物的制备方法及其应用，包括如下步骤：

（1）海带粗多糖溶于水经除蛋白--醇沉--透析--醇沉--浓缩冷冻干燥，得到纯化后的海带多糖；

（2）将提纯过的海带多糖加热溶解于水中。在一定的ph条件下缓慢加入crcl3水溶液至刚出现浑浊为止。取出反应液，离心，取上清液，醇沉，再次离心，取沉淀，用无水乙醇、丙酮洗涤后冷冻干燥，得到海带多糖-铬配合物的粗品；

（3）将海带多糖-铬配合物粗品溶于适量水中，透析、醇沉、离心分离后冷冻干燥，得到纯化后的海带多糖-铬配合物，其中cr元素的含量为4.2wt%；

（4）将无水干燥的样品与kbr混匀、研磨后压片，用红外光谱分析海带多糖和海带多糖-cr配合物的结构差异证明海带多糖和cr已配位。并应用于抗氧化和免疫调节能力活性试验研究。

将海带多糖-铬配合物应用于抗氧化能力和免疫调节能力的活性试验研究，结果显示海带多糖-铬配合物显著提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力。

本发明的有益效果：1、海带多糖-铬配合物目前尚未有合成和具有提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力活性的研究报道，本发明可用于制备抗衰老、免疫调节剂的药物和保健食品中。此新型化合物其最大优点是海带多糖为天然产物提取物，可药食两用；而铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，是维持动物及人体正常生理活动的不可缺少的元素，二者形成螯合物后其性能发生较大变化，它不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，配体和金属离子还会产生协同作用，显著提高机体的抗氧化能力和免疫调节能力，与现有同类药物相比，无毒副小，无不良反应，可长期使用。2、可用于制备抗衰老、免疫调节剂的药物，也可用于制备保健食品。3、原料易得，配合物制备工艺简单，价廉，生产方便，开发价值高。可为开发系列新型高效、安全、不良反应小的抗衰老、免疫调节剂的药物和保健食品奠定基础，为活性多糖-金属螯合物的研究开发奠定基础。

附图说明

图1为海带多糖的红外吸收光谱图；

图2为海带多糖-cr配合物的红外吸收光谱图；

图3为小鼠饲喂药海带多糖、海带多糖-cr配合物前后脾脏指数对比图。

具体实施方式

一、实施例1

1海带粗多糖的提纯

胰蛋白酶液的制备:取1g胰蛋白酶，用ph5.8的nahpo3-nah2po3缓冲液溶解，精确定容至100ml，酶液终浓度为l0mg/ml，ph5.98。

海带粗多糖液（10g→100ml）和胰蛋白酶液以1（100ml）：0.4(40ml)的比例混合，37℃水浴5h后加入0．2(28ml)倍体积ph7．0的10wt％h2o2反应过夜，次日，加入42ml的sevage溶液，放在磁力搅拌仪上剧烈震荡20min，装入离心管中以4000r/min破乳后倒入分液漏斗中静置分层，弃去下层有机相及中间蛋白质层。再取上层水相加入42mlsevage溶液，重复以上操作直至中间界面无杂蛋白为止。（2-3次左右）

在去蛋白后的多糖滤液中加入两倍体积量的无水乙醇，静置12h后倒入离心管以3500r/min的转速离心10min后取沉淀，沉淀分别用95wt％的乙醇、无水乙醇、丙酮各清洗3遍。醇沉洗涤后滤渣加适量蒸馏水，充分复溶后用5ml移液枪将其移入透析袋中并用透析夹夹好两端，将其放入蒸馏水中透析24h。透析完毕后向糖液中加入两倍体积量的乙醇醇沉，离心取其沉淀部分同样用乙醇和丙酮洗涤后放入冷冻干燥机中干燥，干燥后得得海带多糖纯品，装入称量瓶中并将它放置在干燥器里保存备用。

2海带多糖-铬配合物的制备

取2.0g纯化后的海带多糖溶于100ml去离子水，70℃水浴搅拌，然后滴加1mol/lcrcl3（约相当于0.5gcrcl3）和1mol/lnaoh，维持溶液的ph9,滴至有浑浊出现，再稍滴加几滴后即停止滴加，然后让反应液继续70℃水浴保温1h。取出反应液，冷却至室温后倒入离心管中以6000r/min转速离心8min，取上清液，加入两倍体积量95wt%乙醇一段时间后再次离心，此次取沉淀，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤后冷冻干燥，得到海带多糖-铬配合物的粗品。

将海带多糖-铬配合物粗品用少量去离子水完全溶解后装入透析袋除盐，透析24h后，取出透析袋内的溶液并加入两倍体积量的95wt%乙醇，放置一段时间使海带多糖-铬配合物充分析出后离心，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮洗涤，最后冷冻干燥得到纯化后的海带多糖-铬配合物，其中cr元素的含量为4.2wt%。

3海带多糖铬配合物红外光谱分析

将无水干燥的海带多糖-铬配合物与kbr混匀、研磨后压片，用红外光谱仪分析海带多糖、以及海带多糖-cr配合物的结构差异，结果如图1和图2所示。

1、由纯化海带多糖的图谱可得：

3420.28cm^-1，o-h或n-h的伸缩振动；1635.67cm^-1，c=o、c=nr、c=c、n=n、n=o的伸缩振动；1225.45cm^-1，可能为酚中c-o键的伸缩振动；1072.65cm^-1、1033.37cm^-1可能为醇中c-o键的伸缩振动。

2、纯化海带多糖-铬配合物的图谱可得：

3436.63cm^-1是羟基的典型吸收峰，与纯化海带多糖吸收峰相比，络合物吸收谱带略微变宽，强度变化不大，波数增大，略微红移，可能是cr³⁺与海带多糖分子中部分羟基氧形成的配位键，使吸收峰向高波数方向移动。1635.54cm^-1与纯化海带多糖吸收峰相比并无多大差异，基本重合，故此处的氧、氮原子没有与cr³⁺配位。1072.65cm^-1、1033.37cm^-1是c-oh键的典型吸收峰，与纯化海带多糖吸收峰相比，络合物的吸收峰在波数为1038.78cm^-1出现，而1072.65cm^-1、1033.37cm^-1两峰消失，可能为醇中的c-oh键中的h解离，c-o键o被配位所致。

可见海带多糖与cr³⁺发生了络合反应，形成了多糖-铬络合物。

4海带多糖-铬配合物的小鼠免疫调节活性

4.1动物分组及处理

本实验设置空白组、海带多糖组、无机铬组、海带多糖-cr配合物高、中、低剂量组，共六个组，每组10只小鼠。海带多糖组给药量为100mg/kg,无机铬组给药量10mg/kg,海带多糖铬低剂量组给药量为25mg/kg,中剂量组给药量为50mg/kg，高剂量组给药量为100mg/kg。每天灌胃给药1次，每次0.2ml，连续给药9天。

4.2免疫活性指标的测定

本实验通过眼球摘除取血法收集血液，5000r/min离心10分钟分离血清冷藏备用，将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃）。超氧化物歧化酶活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；过氧化氢酶的测定原理为过氧化氢酶分解过氧化氢的反应通过加入钼酸铵中止，剩余的过氧化氢与钼酸铵产生淡黄色的络合物，以此测其含量；乳酸脱氢酶活性测定则通过采用丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下显棕红色，故可通过比色法求得；补体c3、c4活性则采用了免疫比浊法来测定。

通过试剂盒测定，试剂盒均购自南京建成生物技术研究所，操作按各说明书进行。

4.3小鼠的脾脏指数

表1各实验组小鼠的脾脏指数实验结果

由表1可知：多糖-cr高剂量组、多糖-cr中剂量组脾脏指数均比空白组、多糖组、无机铬组高。多糖-cr各剂量组脾脏指数均比空白组、多糖组高。

4.4超氧化物歧化酶（sod）含量测定

表2：海带多糖-cr配合物对小鼠血清超氧化物歧化酶（sod）活性的影响

由表2可知：多糖-cr各剂量组sod含量均比空白组、多糖组和铬组高。

4.5过氧化氢酶（cat）活力测定

表3：海带多糖-cr配合物对小鼠血清过氧化氢酶（cat）活力的影响

由表3可知：多糖-cr各剂量组cat活力均比空白、多糖组和无机铬组高。

4.6乳酸脱氢酶（ldh）活性测定

表4：海带多糖-cr配合物对小鼠血清乳酸脱氢酶（ldh）活性的影响

由表4可知：多糖-cr高、中剂量组ldh活性均比空白组、多糖组和铬组高。

4.7补体c3、补体c4含量测定

表5：海带多糖-cr配合物对小鼠血清补体c3、补体c4含量测定的影响

由表5可知：多糖-cr各剂量组c3含量均比铬组、多糖组低。c4含量变化规律性较差，可能是实验误差或其他原因，有待进一步研究。

5结论

通过胰蛋白酶-sevage联用法将海带多糖纯化,制得精制海带多糖。海带多糖与三价铬离子在弱碱性条件下络合成海带多糖-cr配合物，采用红外光谱仪分析产品配位结构；本实验通过试剂盒测定小鼠血清中超氧化物歧化酶（sod）、乳酸脱氢酶（ldh）、过氧化氢酶（cat）、补体c3及c4的活性，以此初步探讨海带多糖-cr配合物的免疫调节活性。结果表明，海带多糖与三氯化铬(1mol/l)在ph值9左右、反应温度70℃条件下合成,制得海带多糖铬。免疫调节活性实验发现，小鼠灌胃给药海带多糖-铬络合物后脾脏指数、cat、sod、ldh含量均有一定程度的提高，说明海带多糖铬配合物能提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。