用于鉴定长岭发垫刃线虫的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于植物线虫鉴定领域，具体涉及用于鉴定长岭发垫刃线虫的分子标记；还涉及用于鉴定该线虫的特异性引物，以及利用该分子标记或特异性引物鉴定长岭发垫刃线虫的方法。

背景技术：

长岭发垫刃线虫(trichotylenchuschanglingensis)是一种迁移性植物外寄生线虫，属于发垫刃线虫属(trichotylenchus)。2011年该线虫首次在马铃薯的根际土壤中发现(xucletal.,nematology,2011，13(1):45-49)。该线虫能引起玉米叶片黄化、植株矮化、茎基部开裂、茎节缩短等症状(郭宁等.植物保护学报.2015,42(6):884-8910)，对玉米的危害十分严重。

国内外对长岭发垫刃线虫的研究较少，传统的鉴定方法主要是基于形态特征，但是这种方法对操作人员的技术要求高，必须具有高度的线虫分类学专业技能，而一般操作人员不具备这种能力；此外，通常线虫样品数量少，有时仅有1个，也增加了鉴定难度，因此，通过形态特征对线虫进行鉴定的难度极大。以pcr为基础的分子生物学检测技术为线虫鉴定提供了新的途径，本发明人曾以its区和28s区为靶标区，采用线虫通用引物对长岭发垫刃线虫进行pcr鉴定，但是由于通用引物缺少特异性，检测单条线虫效果较差(葛建军等，植物病理学报，2007，37(5)：472-478)，因此，利用通用引物无法实现对长岭发垫刃线虫的准确鉴定。

双重pcr(duplexpcr)是指同一反应体系里含有两对引物，同时扩增两个核酸片段的pcr反应。双重pcr不仅具有普通pcr的高灵敏度，而且有更高的特异性。双重pcr已广泛用于线虫的分类鉴定，如专利申请《一对用于贝西滑刃线虫pcr检测的特异性引物及其使用方法》(cn105603060a)公开了利用双重pcr鉴定贝西滑刃线虫的特异性引物和鉴定方法。

经检索，没有发现用于鉴定长岭发垫刃线虫的分子标记或特异性引物。

技术实现要素：

针对长岭发垫刃线虫形态鉴定对操作人员技术要求高，以及利用通用引物进行pcr检测鉴定效果差等问题，本发明目的在于提供一种用于鉴定长岭发垫刃线虫的分子标记。

本发明另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的引物。

本发明第三目的在于提供用于鉴定长岭发垫刃线虫的pcr检测试剂盒。

本发明第四目的在于提供利用上述引物鉴定长岭发垫刃线虫的方法。

本发明第五目的在于提供一种用于鉴定长岭发垫刃线虫的双重分子标记。

本发明第六目的在于提供一种用于扩增上述双重分子标记的双重引物。

本发明第七目的在于提供用于鉴定长岭发垫刃线虫的双重pcr检测试剂盒。

本发明第八目的在于提供一种利用上述双重引物鉴定长岭发垫刃线虫的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明用于鉴定长岭发垫刃线虫的分子标记，所述的分子标记由seqidno.1所示的核苷酸序列组成。

所述的分子标记的dna片段大小为520bp。

本发明还提供了用于扩增上述分子标记的引物，所述的引物由tc-f1和tc-r1组成；其中所述的tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列组成；所述的tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列组成；

tc-f1：5’-attgtgtgtcctgtctgcg-3’(seqidno.2)，

tc-r1：5’-gcaaagcaccatcctcaag-3’(seqidno.3)。

本发明还提供了用于鉴定长岭发垫刃线虫的pcr检测试剂盒，所述的试剂盒中含有上述引物tc-f1和tc-r1；其中所述的tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列组成；所述的tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列组成。

上述pcr检测试剂盒，还包括10×extaqbuffer(mg²⁺)、5u/μlextaq聚合酶、2.5mmol/ldntpsmixture和ddh2o。

上述引物在长岭发垫刃线虫(trichotylenchuschanglingensis)鉴定或检测上的应用。

上述应用中所述的引物由seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供了利用上述引物鉴定长岭发垫刃线虫的方法，包括提取待测线虫dna；以待测线虫dna为模板，以tc-f1和tc-r1为引物进行pcr扩增，将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，如果所得pcr扩增产物大小为520bp，即为长岭发垫刃线虫。

上述方法中所述的待测线虫dna，可以通过单条线虫提取。

上述方法中所述的引物tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列组成；所述的引物tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列组成。

上述方法中所述的pcr反应体系(25μl)为：12.5μl2*estaqmastermix，模板dna0.5μl，正反引物(10μmol·l^-1)各0.3μl，最后补足ddh2o至25μl。

上述方法中所述的pcr反应程序为：95℃4min；95℃30s，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min。

本发明还提供了用于鉴定长岭发垫刃线虫的双重分子标记，包括上述分子标记，还包括由seqidno.4所示的核苷酸序列组成的分子标记2。

所述分子标记2的dna片段大小为780bp。

本发明还提供了用于扩增上述双重分子标记的双重引物，所述的双重引物包括上述引物tc-f1和tc-r1，还包括引物d2a和d3b；其中所述的tc-f1由seqidno.2所示的核苷酸序列组成；所述的tc-r1由seqidno.3所示的核苷酸序列组成；所述的d2a由seqidno.5所示的核苷酸序列组成；所述的d3bd3b由seqidno.6所示的核苷酸序列组成；

d2a：5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’(seqidno.5)；

d3b：5’-tcggaaggaaccagctacta-3’(seqidno.6)。

用于长岭发垫刃线虫的双重pcr检测试剂盒，包括引物tc-f1和tc-r1，以及引物d2a和d3b；其中所述的d2a由seqidno.5所示的核苷酸序列组成；所述的d3b由seqidno.6所示的核苷酸序列组成。

上述双重pcr检测试剂盒，还包括10×extaqbuffer(mg²⁺)、5u/μlextaq聚合酶、2.5mmol/ldntpsmixture和ddh2o。

用于鉴定长岭发垫刃线虫的双重pcr方法，包括提取待测线虫dna；以待测线虫dna为模板，以tc-f1和tc-r1、以及d2a和d3b为引物进行pcr扩增，然在将扩增产物在在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，如果所得的扩增产物的大小分别为520bp和780bp的2个核苷酸片段，即为长岭发垫刃线虫。

上述双重pcr方法中所述的待测线虫dna，可以通过单条线虫提取。

上述双重pcr方法中所述的pcr反应体系为：10×extaqbuffer(mg²⁺)2.5μl、5u/μlextaq聚合酶0.2μl、模板dna0.5μl，2.5mmol/ldntpsmixture2μl、引物tc-f1/tc-r1各0.5μl、d2a/d3b(10μmol·l^-1)各1μl，最后补足ddh2o至25μl。

上述双重pcr方法中所述的pcr反应程序为：95℃4min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min。

与现有技术相比,本发明具有的优点和有益效果：(1)、本发明针对长岭发垫刃线虫设计的引物特异性强，对长岭发垫刃线虫的鉴定准确度高、可靠性强；(2)、本发明方法检测灵敏度高，单条线虫dna的1/32×(浓度0.125ng/μl)时，都能扩增出清晰、稳定的条带，(3)本发明检测方法简单、检测速度快、效率高；(4)本发明对操作人员要求低，不需要具备线虫分类专业知识，一般的技术人员皆可完成。

附图说明

图1为以tc-f1/tc-r1为引物检测长岭发垫刃线虫的pcr扩增产物电泳图谱；其中m为dnamarkerdl2000；1为heb1；2为heb2；3为heb3；4为sy1；5为cc1；6为qd1；7为zb1；8为xt1；9为d1；10为m1；11为h1；12为p1；13为c1；14为ddh2o阴性对照。

图2为本发明双重pcr方法检测长岭发垫刃线虫的电泳图谱；其中m为dnamarkerdl2000；1为heb1；2为heb2；3为heb3；4为sy1；5为cc1；6为qd1；7为zb1；8为xt1；9为d1；10为m1；11为h1；12为p1；13为c1；14为ddh2o阴性对照。

图3为双重pcr方法中长岭发垫刃线虫模板底物浓度的灵敏度试验电泳图谱；其中m为dnamarkerdl2000；1为1/4×；2为1/8×；3为1/16×；4为1/32×；5为1/64×；6为1/128×；7为1/256×；8为1/512；9为ddh2o阴性对照。

具体实施方式

主要试剂:蛋白酶k、10xpcrbuffer、10xextaqbuffer、dntpmix、extaq、dh5ɑ、pmd19-tvector购自宝生物工程有限公司；2xeasytaqsupermix购自北京全式金生物技技有限公司；50xtae生工生物工程股份有限公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成。

实施例1、本发明长岭发垫刃线虫特异性引物的设计及引物特异性的pcr检测试验

按照如下方进行：

(一)试验材料及来源

1、长岭发垫刃线虫：heb1、heb2、heb3、sy1、cc1、qd1、zb1和xt1共8个。

2、其他线虫：小杆线虫c1、茎线虫d1、根结线虫m1、孢囊线虫h1和短体线虫p1。

以上线虫均保存于河北省农林科学院植物保护研究所。

(二)试验方法

(1)单条线虫dna提取。将线虫置于灭菌去离子水中清洗，挑取单条线虫放入10μl裂解缓冲液(1×pcrbuffer(mg²⁺)、1μg蛋白酶k)中，65℃水浴1min，液氮处理2min，反复冻融数次后，56℃孵育20min，95℃加热10min，得到dna提取液，可直接用于pcr扩增或-20℃保存备用。

(2)特异性引物的设计。根据测序获得的长岭发垫刃线虫群体its区核酸序列，同时检索下载genbank数据库中与该线虫同源性比例高的线虫，通过clustalx1.81软件进行序列比对分析差异位点，利用primer5.0设计长岭发垫刃线虫特异性引物。所设计的特异性引物序列如下：

tc-f1：5’-attgtgtgtcctgtctgcg-3’(seqidno.2)；

tc-r1：5’-gcaaagcaccatcctcaag-3’(seqidno.3)。

(3)pcr扩增。以步骤(1)中提取的线虫dna为模板，以tc-f1和tc-r1为引物进行pcr扩增，得扩增产物。其中pcr反应体系(25μl)为：其中12.5μl2*estaqmastermix，模板dna0.5μl，正反引物(10μmol·l^-1)各0.3μl，最后补足ddh2o至25μl；设无模板阴性对照。pcr反应程序为：95℃4min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35个循环；最后72℃10min。

(4)将步骤(3)中所得的pcr扩增产物，每个样品取5ul在1％琼脂糖凝胶上进行电泳40min，电压为160v；然后将凝胶放入eb染液中染色15min，再置于凝胶成像系统中观察并拍照。

结果8个长岭发垫刃线虫(见图1泳道1-8)中均扩增出1条长度为520bp的特异dna片段，而其他种类线虫(见图1泳道9-13)及阴性对照(ddh2o)(见图1泳道14)中无扩增条带出现。说明tc-f1/tc-r1引物是长岭发垫刃线虫的特异性引物。

(5)将步骤(4)中的特异性片段回收，送交上海生工生物工程有限公司进行测序，再进行blast比对。

测序结果见seqidno.1所示的核苷酸序列。blast比对结果证明520bp的pcr产物即为长岭发垫刃线虫的特有dna片段，即分子标记。

上述结果说明上述tc-f1/tc-r1引物即为长岭发垫刃线虫的特异性引物；上述520bp的特异dna片段即为鉴别长岭发垫刃线虫的分子标记。

实施例2、本发明双重pcr方法检测长岭发垫刃线虫特异性试验

(一)试验材料：同实施例1的(一)。

(二)试验方法：

(1).单条线虫dna提取。同实施例1的(二)(1)。

(2).双重pcr扩增。以线虫dna为模板，以tc-f1/tc-r1、d2a/d3b为引物进行双重pcr扩增，得扩增产物。其中pcr反应体系为25μl：其中10×extaqbuffer(mg²⁺)2.5μl，5u/μlextaq聚合酶0.2μl，模板dna0.5μl，2.5mmol/ldntpsmixture2μl，引物tc-f1/tc-r1各0.5μl，d2a/d3b(10μmol·l^-1)各1μl，最后补足ddh2o至25μl，设无模板阴性对照。pcr反应程序：95℃4min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min；16℃保存。其中所述的引物d2a和d3b为28s区的通用引物，作为内标引物：

d2a：5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’(seqidno.5)；

d3b：5’-tcggaaggaaccagctacta-3’(seqidno.6)。

(3).电泳检测。同实施例1。

结果(见图2)8个长岭发垫刃线虫(泳道1-8)均扩增出2条清晰、稳定的条带，其中大小为780bp的条带是由内标引物d2a/d3b扩增产生，大小为520bp的条带是由长岭发垫刃线虫特异性引物tc-f1/tc-r1扩增产生；在其它植物寄生线虫(泳道9-13)中只有内标引物d2a/d3b扩增产生条带，无长岭发垫刃线虫特异性引物条带出现，阴性对照(ddh2o)(泳道14)中无扩增条带，说明本发明双重pcr方法对长岭发垫刃线虫的检测特异性强、准确度高、可靠性强。

将所得的780bp的pcr扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行测序，结果获得seqidno.4所示的核苷酸序列。

实施例3、本发明双重pcr方法检测灵敏度试验

(一)试验材料

以单条线虫dna按1/4×、1/8×、1/16×、1/32×、1/64×、1/128×、1/256×、1/512×进行浓度梯度稀释。

(二)试验方法

(1).heb1单条线虫dna提取方法同实施例1。

(2).双重pcr扩增方法同实施例2。

(3).电泳检测同实施例1。

结果(见图3)单条线虫dna为1/4×(浓度1ng/μl)至1/32×(浓度0.125ng/μl)(见图3泳道1-4)时，都能扩增出清晰、稳定的条带，即在很低的0.125ng/μl模板浓度下都可以进行检测，说明本发明双重pcr检测方法灵敏度高。

sequencelisting

<110>河北省农林科学院植物保护研究所

<120>用于鉴定长岭发垫刃线虫的分子标记及其应用

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