荧光定量PCR检测树鼩常见感染相关细胞因子的引物对、探针、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物技术和基因检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的引物对、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

树鼩(tupaiabelangeri，treeshrew)是一种形似松鼠的小型哺乳动物，在分类学上属于哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀鼩目(scandentia)。树鼩主要分布在热带和亚热带，我国云南、广西、广东和海南等地广泛分布，同时在东南亚的印度恒河北部、缅甸、越南、泰国、马来西亚、印尼和菲律宾等地也都有分布。

树鼩具有体型小，繁殖快，价较廉，易驯养和饲育，新陈代谢比犬、鼠等动物更接近于人，解剖结构也更近似于人，是一种重要的新型实验动物，它的许多分子与细胞结构与人类近似。在医学生物学上的用途很多，受到许多学者的重视。目前利用树鼩开展的研究已经涉及到形态解剖学、生态学、行为学、人类学、生物化学、遗传学、心理学、神经生物学、繁殖生物学、胚胎学、寄生虫学、病毒学、免疫学、病理学以及运动生理、急慢性压力的影响和应激等社会生物学的研究。

树鼩作为一种新的优质动物模型，其研究还处于早期阶段，目前其重要的配套资源如重要蛋白的抗体的商品化仍未做到如小鼠等动物的全面。细胞因子水平是研究机体免疫活动的重要指标，但由于目前树鼩还未有成熟的商品化的细胞因子抗体，无法进行基于抗原抗体技术的细胞因子水平检测。但得益于树鼩全基因组数据的获得，可以通过检测相关mrna的方法进行细胞因子检测。

技术实现要素：

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的引物对、探针、试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的引物对，所述引物对为：针对il-6检测的如seqidno:1和seqidno:2所示的碱基序列、针对il-8检测的如seqidno:3和seqidno:4所示的碱基序列、针对il-10检测的如seqidno:5和seqidno:6所示的碱基序列、针对il-17a检测的如seqidno:7和seqidno:8所示的碱基序列、以及针对inf-γ检测的如seqidno:9和seqidno:10所示的碱基序列。

在其中一些实施例中，所述引物对还包括针对内参树鼩gapdh检测的如seqidno:11和seqidno:12所示的碱基序列。

本发明还提供了一种荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的探针，所述探针为：针对il-6检测的如seqidno:13所示的碱基序列、针对il-8检测的如seqidno:14所示的碱基序列、针对il-10检测的如seqidno:15所示的碱基序列、针对il-17a检测的如seqidno:16所示的碱基序列、以及针对inf-γ检测的如seqidno:17所示的碱基序列。

在其中一些实施例中，所述探针还包括针对内参树鼩gapdh检测的如seqidno:18所示的碱基序列。

在其中一些实施例中，所述探针的5'端标记有fam荧光报告基团，3'端标记有bhq1荧光淬灭基团。

本发明还提供了一种荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的试剂盒，所述试剂盒包括针对il-6检测的如seqidno:1～2所示的引物对和如seqidno:13所示的探针、针对il-8检测的如seqidno:3～4所示的引物对和如seqidno:14所示的探针、针对il-10检测的如seqidno:5～6所示的引物对和如seqidno:15所示的探针、针对il-17a检测的如seqidno:7～8所示的引物对和如seqidno:16所示的探针、以及针对inf-γ检测的如seqidno:9～10所示的引物对和如seqidno:17所示的探针。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括针对内参树鼩gapdh的如seqidno:11～12所示的引物对和如seqidno:18所示的探针。

本发明还提供了一种荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的方法，以上述引物和探针，进行荧光定量pcr扩增，检测。

在其中一些实施例中，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：样品核酸模板5μl、5×reactionbuffer5μl、正向引物7-15pmol、反向引物7-15pmol、探针0.5-5pmol、m-mlv逆转录酶50u、taqdnapolymerase1u、rnase-freedh2o补足25μl。

在其中一些实施例中，所述荧光定量pcr扩增的反应程序为：48℃10分钟；94℃2分钟；94℃10秒、55℃35秒，40个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明基于taqman探针法荧光定量pcr检测，通过对常见的感染相关细胞因子：interleukin-6(il-6)、il-8、il-10、il-17a、interferon-γ(inf-γ)设计特异性引物对和探针，同时以树鼩管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(reducedglyceraldehyde-phosphatedehydrogenase,gapdh)mrna作为内参，设计相应的引物对和探针，用于监测样品效果及用于相对定量分析。设计的引物对和探针具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点，有利于体内细胞因子水平研究分析。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。

图1为本发明试验例1中测序分析树鼩细胞因子荧光定量pcr的扩增片段图；

图2为本发明试验例2中树鼩细胞因子及其内参gapdh荧光定量pcr扩增的线性范围及标准曲线图；

图3为本发明试验例3中树鼩细胞因子及其内参gapdh荧光定量pcr最低检测模板的扩增曲线图。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。

实施例1树鼩常见感染相关细胞因子荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

本实施例的树鼩常见感染相关细胞因子荧光定量pcr检测试剂盒包括以下成分：

1、树鼩il-6、il-8、il-10、il-17a、inf-γ及内参树鼩gapdh跨内含子引物、探针

通过genebank中树鼩的il-6、il-8、il-10、il-17a、inf-γ及内参树鼩gapdhmrna的序列资料及树鼩基因组序列信息，对跨内含子保守区进行引物探针设计，详细序列见表1所示。

表1跨内含子细胞因子引物及探针序列

2、其他检测试剂

使用优化的5×一步法rt-pcr缓冲液(5×reactionbuffer(250mmtris-cl[ph8.9])，375mmkcl，20mmmgcl2，50％甘油)进行试剂配制。

单次反应总体积为25μl，其中

3、检测方法

采用上述pcr反应体系，进行荧光定量pcr反应，pcr反应程序为：48℃10分钟；94℃2分钟；94℃10秒、55℃35秒、40个循环(读值)，使用abi7500荧光定量pcr仪。

试验例1本发明实施例1的检测方法的特异性和排除dna干扰能力试验

为验证本发明方法的特异性和排除dna干扰能力，设计如下实验：

1、使用树鼩血液淋巴细胞、狗来源的mdck细胞、人来源的hep-2细胞及e.coli进行特异性检测，并通过测序验证；

2、同时设置加或不加逆转录酶m-mlv实验，验证跨内含子引物探针设计的排除dna干扰的能力。

步骤如下：

(1)rna提取采用常规trizol(或柱提取法提取)提取。实验分别取2只树鼩各1ml抗凝全血，使用常规淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，加入500μltrizol中进行rna提取，最终得到50μl提取产物；分别提取细胞数为5×10⁵左右的mdck细胞2例、hep-2细胞2例及1ml过夜培养的e.colitop10、e.colidh5а各1例作为对照；

(2)一组使用含有m-mlv的完全配方试剂；另一组使用不含有m-mlv的不完全配方试剂(其他成分都一样)各20μl/反应，分别加入提取的核酸各5μl。上机，反应条件为：48℃10分钟，94℃2分钟，40个循环条件为94℃10秒、55℃35秒(读值)。设备使用abi7500荧光定量pcr仪，扩增结果见表2所示。

表2特异性检测及排除dna干扰测试结果

注：“–”为阴性；m-mlv(+)为完全配方加入逆转录酶；m-mlv(-)为不完全配方不加入逆转录酶。il：interleukin；inf-γ：interferon-γ；gapdh：磷酸甘油醛脱氢酶(reducedglyceraldehyde-phosphatedehydrogenase)。

表2结果表明本发明的细胞因子检测体系具有良好的特异性和排除dna干扰的能力，未在非树鼩来源的样品中检测出阳性。

(3)扩增后阳性片段使用胶回收后用于pmd-18t(takara)连接，通过连接、转化、单克隆挑取培养后用于测序分析，并对比结果是否为正确的树鼩细胞因子序列。特异性筛选测序结果见图1所示，结果对比表明确为树鼩目标核酸。同时，未加逆转录酶的样品检测中都为阴性，说明跨内含子设计的引物探针组合可以排除dna的干扰，解决了样品中dna去除的问题。保证了实验的准确性。

综上，所设计的树鼩常见感染相关的细胞因子荧光定量pcr检测方法具有良好的特异性。

试验例2本发明的检测试剂的扩增线性范围及标准曲线

使用已经构建的含有树鼩目标检测片段的t载体克隆质粒作为灵敏度实验样品，对其线性范围及最低检测水平进行检测验证。具体如下：

(1)质粒dna提取，提取含il-6、il-8、il-10、il-17a、inf-γ及gapdh各目标片段的t载体克隆质粒dna；

(2)使用nanodropone(thermoscientific)测量其各自浓度。

(3)根据其各自分子量和浓度，再根据1摩尔数与6.02214129×10²³分子数，摩尔＝质量/分子量计算得出各质粒最终的分子浓度分别为5.85×10¹⁰copies/μl、6.76×10¹⁰copies/μl、7.02×10¹⁰copies/μl、6.46×10¹⁰copies/μl、7.29×10¹⁰copies/μl、5.34×10¹⁰copies/μl；

(4)梯度稀释质粒dna，使模板中分别各含有0.2×10¹⁰、0.2×10⁹、0.2×10⁸、0.2×10⁷、0.2×10⁶、0.2×10⁵、0.2×10⁴、0.2×10³、0.2×10²、0.2×10¹、0.2×10⁰copies/μl的质粒。

(5)使用5μl稀释好的模板进行上机检测，验证实施例1的方法的线性范围。通过检测测得各细胞因子检测试剂线性范围及标准曲线方程如表3、图2所示。

表3荧光定量pcr扩增线性范围及标准曲线

表3和图2结果可见，所建立的方法的有较宽的线性范围，标准曲线的线性相关系数r²均大于0.99，说明所建立的系列试剂适用于不同浓度的样品检测。同时其标准曲线基本平行，有利于进行相对定量分析。

试验例3本发明的检测试剂盒的最低检测量

为验证本发明的试剂盒的最低核酸检测量，使用低浓度的含目标片段的t载体质粒dna，逐步稀释后进行扩增检测。

(1)使用0.2×2¹⁰copies/μl(5μl上样量为1024copies)的含各目标片段的t载体质粒作为模板，2倍倍比稀释至0.2×2⁰(5μl上样量为1copy)即：0.2×2¹⁰、0.2×2⁹、0.2×2⁸、0.2×2⁷、0.2×2⁶、0.2×2⁵、0.2×2⁴、0.2×2³、0.2×2²、0.2×2¹、0.2×2⁰copies/μl。

(2)使用5μl稀释好的模板进行上机检测。

结果如图3所示，结果表明，本发明的试剂最低可检测到：il-6：8copies、il-8：8copies、il-10：4copies、il-17a：8copies、inf-γ：128copies及gapdh：4copies。其扩增曲线在此浓度下仍可清晰判断阴阳性。

综合以上试验例1～3表明，本发明的常见感染相关的树鼩细胞因子及其内参gapdh荧光定量pcr检测试剂盒具有特异性高、灵敏度高、线性范围广等特点，可以用于树鼩常见感染相关的细胞因子检测工作，具有良好的应用前景。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州医科大学附属第一医院

<120>荧光定量pcr检测树鼩常见感染相关细胞因子的引物对、探针、试剂盒及方法

<160>18

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