一种喉鳞癌的诊断标志物及其治疗靶标的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种喉鳞癌的诊断标志物及其治疗靶标，具体的所述诊断标志物及其治疗靶标为myoz3。

背景技术：

喉癌分原发性和继发性两种。原发性喉癌指原发部位在喉部的肿瘤，以鳞状细胞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma，lscc)最为常见，占90％以上。喉癌的发生是经过多个阶段逐步发展形成的，从正常黏膜、增生肥厚、轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、侵袭性癌到转移。

随着生物技术的发展，人们对喉鳞癌的发生发展有了一定的了解，但是其具体发病机制仍不清楚。喉癌虽可通过手术、化疗、放疗等多种手段进行综合治疗，但仍有部分患者，虽经根治手术和放化疗，仍因局部复发或转移，难以救治以致死亡。喉癌依然严重威胁着患者的生命安全，迫切需要找到更为有效的肿瘤诊断和治疗方法。

高通量技术的发展为疾病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，高通量测序技术因其产生数字化信号、高灵敏度以及全基因组分析而得到广泛的应用。通过对患者的样本进行高通量测序，寻找在疾病中差异表达的基因，并通过进一步实验排除假阳性，发现与疾病发生发展直接相关的基因，从而为疾病机理的研究，以及疾病的预测和药物开发提供研究基础。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种喉鳞癌的诊断标志物，通过检测样本中标志物的表达水平来判断患者是否患有喉鳞癌或者患喉鳞癌的风险。

本发明的目的之二，提供一种喉鳞癌的治疗靶标，通过改变患者中靶标的表达水平，从而达到治疗喉鳞癌的目的。

本发明的目的之三，提供一种筛选预防或治疗喉鳞癌的潜在物质的方法，通过所述物质能否调节生物靶标的表达水平来判断所筛选的物质是否是预防或治疗喉鳞癌的潜在物质。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测myoz3表达水平的试剂在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。其中，所述产品可以通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片技术等检测技术来检测myoz3的表达。

本发明提供了一种芯片、制剂或试剂盒，包括检测样本中myoz3基因或其编码的蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性识别myoz3的探针或特异性扩增myoz3的引物；或特异性结合myoz3编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，所述试剂至少包括一对特异性扩增myoz3的引物，优选的所述特异性扩增myoz3的引物的序列如seqidno.1～2所示。

在本发明中，所述芯片、制剂或试剂盒可用于检测包括myoz3在内的与喉鳞癌相关的多个基因和/或其表达产物的表达水平。多个基因联合诊断，可以增加喉鳞癌诊断的准确性。

本发明提供了myoz3在筛选预防或治疗喉鳞癌的潜在物质中的应用。

进一步，所述潜在物质为可以促进myoz3基因和/或其编码的蛋白表达水平或活性的物质。

进一步，筛选潜在物质的步骤如下：

用候选物质处理表达或含有myoz3基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中myoz3基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可促进myoz3基因或其编码的蛋白的表达或活性(优选显著升高，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高2倍以上)，则表明该候选物质是预防或治疗喉鳞癌的潜在物质。

进一步，所述步骤还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从潜在物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗喉鳞癌有用的物质。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。所述候选化合物包括(但不限于)：针对myoz3基因或其上游或下游基因设计的核酸促进物、蛋白促进剂、蛋白结合分子。

本发明提供了myoz3功能性表达的促进剂在制备治疗喉鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述促进剂包括提高myoz3基因或其表达产物稳定性、上调myoz3基因或其表达产物的表达水平、增加myoz3基因或其表达产物有效作用时间的物质。

本发明提供了一种治疗喉鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括myoz3功能性表达的促进剂。所述促进剂包括提高myoz3基因或其表达产物稳定性、上调myoz3基因或其表达产物的表达水平、增加myoz3基因或其表达产物有效作用时间的物质。

进一步，所述药物组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

附图说明

图1是利用qpcr检测myoz3基因在喉鳞癌组织中的表达情况图；

图2是利用westernblot检测myoz3蛋白在喉鳞癌组织中的表达情况图；

图3是myoz3在喉鳞癌细胞中的转染情况图；其中，图a是利用qpcr检测转染对喉鳞癌细胞中myoz3mrna表达的影响图；图b是利用westernblot检测转染对喉鳞癌细胞中myoz3蛋白的影响图；

图4是用mtt法检测myoz3基因对喉鳞癌细胞增殖的影响图；

图5是用流式细胞仪检测myoz3基因对喉鳞癌细胞凋亡的影响图；

图6是利用细胞划痕实验检测myoz3对喉鳞癌细胞迁移的影响图；

图7是利用transwell小室检测myoz3对喉鳞癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测喉鳞癌标本中基因在肿瘤组织和正常癌旁粘膜组织的表达，发现其中具有明显表达差异的基因，探讨其与喉鳞癌的发生之间的关系，从而为喉鳞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了喉鳞癌中myoz3显著性下调。实验证明，通过增加myoz3的表达水平，能够有效地抑制喉鳞癌细胞的生长、凋亡和侵袭，提示检测myoz3基因的表达水平可成为喉鳞癌早期诊断的辅助诊断指标之一，上调myoz3基因表达可成为预防或治疗喉鳞癌或喉鳞癌转移的新途径。

myoz3基因

myoz3是位于人5号染色体长臂3区3带上，本发明中的myoz3包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的myoz3基因序列如目前国际公共核酸数据库genebank中myoz3基因(nc_000005.10)所示。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

芯片、制剂、试剂盒

在本发明中，“芯片”、“微阵列”、“阵列”可以等同替代，包括(但不限于)：dna微阵列(例如，cdna微阵列和寡核苷酸微阵列)、蛋白质微阵列、组织微阵列、转染或细胞微阵列、化学化合物微阵列和抗体微阵列。通常称为基因芯片、dna芯片或生物芯片的dna微阵列是微观dna点的集合，这些点连接到固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于对数千种基因同时进行表达谱分析或表达水平监测的阵列。固定的dna片段称为探针，其数千个可用于单个dna微阵列中。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达而识别疾病基因或转录本(例如，ncrna)。微阵列可使用多种技术加以制造，包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上、使用预制的掩模进行光刻、使用动态微镜器件进行光刻、喷墨印刷或微电极阵列上的电化学方法。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中针对myoz3基因的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测myoz3的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取rna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

在本发明中，与myoz3特异性结合的抗体或配体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与myoz3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体

促进剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种所述myoz3促进剂，所述促进剂包括提高myoz3基因或其表达产物稳定性、上调myoz3基因或其表达产物的表达水平、增加myoz3基因或其表达产物有效作用时间的物质。

通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

作为本发明的一种优选方式，所述的myoz3的促进剂是一种myoz3的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、deae葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

在本发明中，“宿主细胞”胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos、或293细胞的动物细胞等。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的myoz3的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗喉鳞癌。任何前述的myoz3的促进剂均可用于组合物的制备。所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂等添加剂。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。促进剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的myoz3基因的促进剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗喉鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将myoz3的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带myoz3的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，癌组织与正常癌旁粘膜组织的配对比较采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与喉鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例喉鳞癌组织及对应的正常黏膜组织样本，组织样本的取得获得患者的知情同意，并且取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

1)加入液氮研磨组织至粉末，加入1mltrizol(invitrogen)溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；

2)12000rpm4℃离心5min，将上清液转移至1.5mlrnasefreeep管中；

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；

4)4℃环境中12000g离15min，溶液离心为三层，rna在上层水相，移至另一个新的rnasefreeep管；

5)加入0.5ml异丙醇，轻柔充分混匀，室温静置10min；

6)4℃下，12000g离心10min，加入与rnaisoplus等体积的75％乙醇沉淀rna，7500g4℃离心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入30μldepc水溶解沉淀。

8)rna样品的质量分析

利用nanodrop2000对所提取的rna浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rrna

使用ribo-zero试剂盒除去总rna中的核糖体rna。

4、构建cdna文库

利用利用illumina的truseqrnasampleprepkit进行cdna文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用hiseq4000测序平台对cdna文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用tophatv1.3.1进行rna-seq读段定位，通过cufflinksv1.0.3将rna-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.001，|log2(fold_change)normalized|>2时，认为mrna显著差异表达。

7、结果

rna-seq结果显示，在喉鳞癌患者中差异表达的基因有665个，上调的450个，下调的215个，其中基因myoz3在喉鳞癌组织中的表达量显著低于正常癌旁黏膜组织中的表达量。

实施例2qpcr测序验证myoz3基因的差异表达

1、对myoz3基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式选择喉鳞癌患者正常癌旁粘膜组织和喉鳞癌组织各50例。

2、rna提取具体步骤如实施例1所述。

3、逆转录

3、逆转录：采用fastquantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行mrna反转录。具体步骤如下：

(1)加入5×gdnabuffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min；

(2)构建20μl反应体系，10×fastrtbuffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混匀；

(3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、qpcr扩增

(1)引物设计

根据genebank中myoz3基因和管家基因gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由博迈德公司合成。

myoz3基因的引物序列：

正向引物序列为5’-actacgcaacaacagagg-3’(seqidno.1)；

反向引物序列为5’-tgctaactcgaaagtgaact-3’(seqidno.2)。

gapdh基因的引物序列：

正向引物序列为5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’(seqidno.3)；

反向引物序列为5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seqidno.4)。

(2)pcr反应体系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×superrealpremixplus10μl，dna模板2μl，ddh2o7.4μl，50×roxreferencedye^△2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。

(3)pcr反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在abi7300型荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与喉鳞癌正常癌旁粘膜组织相比，myoz3在喉鳞癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同高通量测序结果一致。

实施例3蛋白免疫印记实验检测myoz3蛋白的差异表达

1、组织总蛋白的提取

用剪刀剪碎组织后将其放入置于冰内的玻璃匀浆器内，ripa裂解液和pmsf以100:1的比例混匀，按照每20mg组织标本加入100μl裂解液的比例加入相应量的ripa裂解液，玻璃匀浆器碾碎组织直至其充分裂解，将裂解后的液体吸至ep管中，4℃下14000rpm离心5min，收集上清。

2、总蛋白浓度测定

按照bca蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3、sds-page电泳

按照sds-page凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4、western检测

1)电转移

将pvdf膜放入甲醇溶液中激活5min，放入转膜缓冲液中平衡20min。取出page胶放入转膜缓冲液中，切下相应的page胶，按照由下到上依次为滤纸、pvdf膜、page胶、滤纸的顺序放到半干的转膜仪中，恒压25v转膜1.5h；

2)免疫杂交

取出pvdf膜，pbs冲洗后置于5％bsa溶液中室温下摇动封闭2h，将pvdf膜放入杂交袋中，加入一抗过夜，用tbst缓冲液洗涤pvdf膜，再加入相应的二抗，室温下孵育2h，tbst缓冲液洗涤。

3)dab显色

pvdf膜稍干后滴加新鲜配制的dab显色液，pvdf膜显色后扫描记录。以β-actin作为内参照，采用quantityone凝胶成像分析系统对条带进行半定量灰度分析，实验重复3次，结果取平均灰度值；

5、结果

结果如图2所示，myoz3蛋白在喉鳞癌组织中的表达水平显著低于正常癌旁粘膜组织。

实施例4myoz3基因的过表达

1、细胞培养

人喉鳞癌细胞株hep2，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培养基在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

1)转染前细胞的处理

转染前一天，6孔培养板上种3～5×10⁵个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30～50％，于转染前换成无血清培养基。

2)基因过表达载体的构建

根据genebank中myoz3的序列合成特异的pcr扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-ccgaagcttgccaccatgatccccaaggagcag-3’(seqidno.5)

反向引物：5’-cggctcgagcagctcctcggactctgggaggtt-3’(seqidno.6)

在5’端引物和3’端引物分别添加hindiii和xhoi两个限制性酶切位点。以肺腺癌患者组织提取和反转录得到的cdna作为扩增模板，上述cdna序列经限制性内切酶hindiii和xhoi双酶切后插入到经hindiii和xhoi双酶切的真核细胞表达载体pcdna3.1中，连接获得的重组载体pcdna3.1-1用于后续实验。

3)转染

将肺腺癌细胞分为3组，分别为对照组(hep2)、空白对照组(转染pcdna3.1-nc)、实验组(转染pcdna3.1-1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcdna3.1空载体和pcdna3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。

3、qpcr检测myoz3基因的表达水平

1)细胞总rna的提取

采用qiagen的细胞rna提取试剂盒对细胞中的rna进行提取，实验操作按照说明书进行。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)qpcr扩增步骤同实施例2。

4、westernblot检测myoz3蛋白的表达水平

1)细胞总蛋白的提取

收集处于对数期的不同处理组的细胞，用预冷的pbs洗涤细胞。将ripa细胞裂解液和pmsf以100:1的比例混匀，向细胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用细胞刮刀将裂解的细胞刮下来，使用移液器将裂解后的液体吸至ep管中，4℃下14000rpm离心5min。小心收集离心后的上清。

2)总蛋白浓度的测定

按照bca蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3)sds-page电泳

按照sds-page凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4)western检测

步骤详见实施例3。

5、结果

结果如图3显示，与非转染组与转染空白质粒组相比，转染myoz3组中的myoz3过表达，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例5myoz3基因对喉鳞癌细胞增殖的影响

采用mtt实验检测myoz3基因对喉鳞癌细胞增殖能力影响。

1、取生长状况良好的细胞，常规消化成单细胞悬液后，计数细胞，将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液；

2、于96孔培养板中，将稀释后的不同处理组细胞每孔接种2000细胞，至少设3个平行孔，37℃、5％co2培养24h；

3、于接种后1、2、3、4、5天每天取出3孔细胞以mtt法检测其490nm的od值，进行计数，计算平均值；

4、检测前弃去上清液，培养液洗3次，每孔加入mtt无血清培养基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培养箱中继续培养4h；

5、终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μldmso，震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上用波长为490nm测定光密度(od)值，以时间为横轴，光密度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

6、结果

结果如图4所示，与对照相比，实验组细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(p<0.05)，说明myoz3具有抑制细胞增殖的作用。

实施例6myoz3基因对喉鳞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测myoz3基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

1)将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化后吹打成细胞悬液并计数。取10⁶量的细胞悬液，1000rpm离心5min；

2)弃上清，加入195μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞；

3)加入5μl的annexinv-fitc，轻柔混匀，室温下避光孵育10min；

4)1000rpm离心5min，弃上清，加入190μl的annexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞；

5)加入10μl碘化丙啶(pi)染色液，轻柔混匀，冰浴避光放置，进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况，所有实验均重复3次，结果取平均值。

4、结果：

结果如图5所示，实验组与对照组相比，细胞的凋亡率显著升高，说明myoz3的过表达促进喉鳞癌细胞的凋亡(p<0.05)。

实施例7细胞划痕实验

1、向6孔板中每孔加入1ml50μg/ml的纤连蛋白，并置于4℃冰箱中过夜；

2、弃去剩余的纤连蛋白溶液，用无血清培养基清洗，将处于对数生长期的不同处理组细胞经胰酶消化重悬后，接种于铺有纤连蛋白的6孔板中，每组细胞设2个复孔，每孔5×10⁵个细胞；

3、置入37℃、5％co2培养箱中培养过夜；

4、待细胞长至约90％融合时，用10μl的tip头划出一条无细胞的细痕，pbs溶液洗去脱落的细胞，加入无血清培养基继续培养；

5、分别于划痕后0h、48h观察细胞划痕处的愈合情况并拍照。实验重复3次，结果取平均值。

6、结果

结果如图6所示，实验组相比对照组而言，细胞体外划痕后的迁移距离明显降低，而对照组之间无显著差异，说明myoz3过表达可以抑制喉癌细胞的迁移。

实施例8细胞侵袭实验

1、transwell小室制备

将50mg/l的matrigel胶用4℃预冷的无血清培养基以1:8的比例稀释、混匀，包被transwell小室的底部膜的上室面，4℃风干。取60μl～80μl稀释的matrigel胶(3.9μg/μl)置于孔径为8μm的transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被matrigel覆盖，置于37℃30min使matrigel聚合成凝胶。

2、配置细胞悬液

将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化，无血清培养基重悬后，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。

3、细胞接种

在transwell上室加入2ml的细胞悬液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培养基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％co2条件下培养20-24h；取出transwell小室，棉签擦尽上室面的matrigel胶和未穿透膜的细胞。

4、染色

细胞培养结束后，取出transwell小室，棉签擦尽上室面的matrigel胶和未穿透膜的细胞，下室面用95％酒精固定15min后，苏木素染色2min，倒置显微镜下随机取5个高倍镜视野观察、计数并拍照。计数小室下室面的细胞数即为穿透matrigel胶的细胞数，取平均数作为实验结果，并以该细胞数代表肿瘤细胞的侵袭力，实验重复3次，每组细胞设3个复孔。

5、结果

结果如图7所示，与对照组相比，实验组的细胞穿过transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数明显减少，而对照组之间无明显差异，结果说明myoz3过表达可以抑制喉鳞癌的侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

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<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>一种喉鳞癌的诊断标志物及其治疗靶标

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