专利名称：一种真核重组质粒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特备涉及一种真核重组质粒及其制备方法与在制备治疗喉鳞癌的药物中的应用。
背景技术：
近年来，恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。人喉鳞癌是一种常见的恶性肿瘤，现在已经发现部分癌基因(如survivin、c_myc、Bcl-2 等)和抑癌基因(如 p53、DCC、nm23、APC、PTEN、DPC4 等)，所述癌基因和抑癌基因与人喉鳞癌的发 生、发展有密切关系，但是至今还有许多的致癌基因、抑癌基因尚未发现。人FBXL20基因已在GenBank注册，注册号NM_032875，定位于17ql2，全长10381bp，编码436aa。FBXL20的组织表达谱分析显示该基因在脑少突神经胶质细胞瘤、脑星形细胞瘤、前列腺癌、卵巣癌、乳腺癌、睾丸癌、软骨肉瘤中均有表达，FBXL20为F-BOX蛋白家族的新成员，编码产物含ー个F-BOX功能区，现已在人体内发现20余种F-BOX蛋白，有cyclinF、skp2、E3RSIkB、CDC4、b-TrcP、MET30、MD6 等。目前国内外对 F-B0X 蛋白的研究主要是围绕泛素化-蛋白酶体途经(UPP)展开的。
发明内容
本发明的目的是提供ー种新型的真核重组质粒及制备方法，并证明这种真核重组质粒可促进喉鳞癌细胞的凋亡，以便开发出ー种治疗喉鳞癌的新型药物。人FBXL20基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所述。本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO. I所示人FBXL20基因的核苷酸序列中的CY-FBXL20片段与真核载体构建而成，所述CY-FBXL20片段是起始密码子下游10045bp至10063bp的核苷酸序列。本发明所述真核重组质粒，其制备方法依次包括以下步骤(I)通过RNA固相合成法，获得人FBXL20基因中的CY-FBXL20片段的RNAi片段；(2)将所述CY-FBXL20片段的RNAi片段插入到真核载体构建真核重组质粒，该插入片段的酶切位点分别为BamI和Bbsl，再将所述真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；(3)使用碱裂解法抽提所构建的真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所构建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。上述真核重组质粒及其构建方法中，所述真核载体为GPU6、pGPHl、pGPU6/GFP/Neo, pGPU6/Neo、pGPHl/Neo、hU6-MCS-CMV-GFP-SV40_Neomycin、pGPU6/Hygro, pGPHl/Hygro、pGPU6/GFP/Neo、pGPHl/GFP/Neo、Hl-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin、CMV-EGFP-MCS(MIR30) -SV40-Neomycin、CMV-RFP-MCS (MIR30) -SV40-Neomycin 中的ー种。本发明将所构建的真核重组质粒转染入喉鳞癌H印2细胞，实验表明，该真核重组质粒对喉鳞癌细胞具有明显的杀灭作用(见实施例2)，可在制备治疗喉鳞癌的药物中应用。本发明具有以下有益效果I、本发明为制备治疗喉鳞癌的药物提供了ー种新方法，可促进喉鳞癌新药的开发，有利于喉鳞癌恶性肿瘤患者的康复。2、本发明所述真核重组质粒不仅可在制备治疗喉鳞癌的药物中应用，而且可用于探讨喉鳞癌发病的分子机理。
图I是真核载体pGPU6/GFP/Neo的结构示意图。
图2是本发明所述真核重组质粒的一种结构示意图(pGPU6/GFP/Neo/-CY-FBXL20)。图3是靶序列的DNA的双链结构。图4 是 shRNA-CY_FBXL20 转录体。图5是shRNA-CY_FBXL20转录体的ニ级结构。图6是阴性片段DNA双链结构。图 7 是 shRNA-NC 转录体。图8是shRNA-NC转录体的ニ级结构。图9是本发明所述真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY_FBXL20的酶切鉴定图谱。图10是本发明所述真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY_FBXL20的测序图。图11是稳转真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY_FBXL20的喉鳞癌H印2细胞株照片;图12是荧光定量PCR实验中fbxl20的标准曲线图。图13是荧光定量PCR实验中gapah引物的标准曲线图。图14是转染真核重组质粒的喉鳞癌细胞株H印2_CT_FBa2°，阴性对照H印2_，未转染真核重组质粒的喉鳞癌细胞株H印2的fbxl20基因表达的柱状图。图15是流式细胞仪检测转染真核重组质粒的喉鳞癌细胞株Hep2-eY_Fm2°的细胞凋亡图。图16是流式细胞仪检测阴性对照细胞株Ifep2_的细胞凋亡图。图17是流式细胞仪检测未转染真核重组质粒的喉鳞癌细胞株Ifep2的细胞凋亡图。图18是流式细胞仪检测H印2_CT_Fm2°，H印2_ng，H印2细胞株的细胞凋亡率柱状图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进ー步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambroo k, Russell的分子克隆；实验室手册' (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY_FBXL20的制备
I、寡核苷酸的合成
shRNA模板中的loop结构选用了 TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录終止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了 CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了 GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加ー个G。靶序列为5-CCAAATGCTTAGCCAATCT-3，互补链为 3-AGATTGGCTAAGCAITTGG-5 ;靶序列正义链为 5-CACCGCCAAATGCTTAGCCAATCT TTCAAGAGAAGATTGGCTAAGCATTTGGTTTTTTG-3,靶序列反义链为5-GATCCAAAAAACCAAATGCTTAGCCAATCTTCTCTTGAAAGATTGGCTAAGCATTTGGC-3 ；靶序列的DNA的双链结构如图3所示，shRNA-CY_FBXL20转录体如图4所示，shRNA-CY-FBXL20转录体的ニ级结构如图5所示；阴性对照的正义链为5 ' -CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3;，阴性对照的反义链为5' -GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGT GACACGTTCGGAGAAC-3’ ；阴性片段的DNA的双链结构如图6所示，shRNA-NC转录体如图7所示，shRNA-NC转录体ニ级结构如图8所示。2、shRNA模板的退火将靶序列正义链、靶序列反义链、阴性对照正义链、阴性对照反义链的寡核苷酸分别用TE(pH8.0)溶解，浓度均为100 μ M。分别取靶序列正义链、靶序列反义链、阴性对照正义链、阴性对照反义链的寡核苷酸溶液，按照下表配比配制退火反应体系。表I
权利要求
1.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO. I所述人FBXL20基因的核苷酸序列中的CY-FBXL20片段与真核载体构建而成，所述CY-FBXL20片段是起始密码子下游10045bp至10063bp的核昔酸序列。
2.根据权利要求I所述的真核重组质粒，其特征在于所述真核载体为GPU6、pGPHl、pGPU6/GFP/Neo、pGPU6/Neo、pGPHl/Neo、hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin, pGPU6/Hygro、pGPHl/Hygro、pGPU6/GFP/Neo、pGPHl/GFP/Neo、Hl-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin、CMV-EGFP-MCS (MIR30) -SV40-Neomycin、CMV-RFP-MCS (MIR30) -SV40-Neomycin 中的ー种。
3.权利要求I或2所述真核重组质粒在制备治疗喉鳞癌的药物中的应用。
4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤 (1)通过RNA固相合成法，获得人FBXL20基因中的CY-FBXL20片段的RNAi片段； (2)将所述CY-FBXL20片段的RNAi片段插入到真核载体构建真核重组质粒，该插入片段的酶切位点分别为BamI和Bbsl，再将所述真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆； (3)使用碱裂解法抽提所构建的真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所构建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。
5.根据权利要求4所述真核重组质粒制备方法，其特征在于所述真核载体为GPU6、pGPHl、pGPU6/GFP/Neo、pGPU6/Neo、pGPHl/Neo、hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin, pGPU6/Hygro, pGPHl/Hygro、pGPU6/GFP/Neo、pGPHl/GFP/Neo、Hl-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin, CMV-EGFP-MCS (MIR30) -SV40_Neomycin、CMV-RFP-MCS (MIR30) -SV40-Neomycin 中的ー种。
全文摘要
一种真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO.1所示人FBXL20基因的核苷酸序列中的CY-FBXL20片段与真核载体构建而成，所述CY-FBXL20片段是起始密码子下游10045bp至10063bp的核苷酸序列。一种真核重组质粒的制备方法，依次包括以下步骤(1)通过RNA固相合成法，获得人FBXL20基因中的CY-FBXL20片段的RNAi片段；(2)将所述CY-FBXL20片段的RNAi片段插入到真核载体构建真核重组质粒，该插入片段的酶切位点分别为BamI和BbsI，再将所述真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；(3)使用碱裂解法抽提所构建的真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所构建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。所述真核重组质粒可在制备治疗喉鳞癌的药物中的应用。
文档编号C12N15/79GK102643854SQ20121013123
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者朱剑军, 陈尧 申请人:四川大学