专利名称：一种喉鳞癌软骨侵袭模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种喉鳞癌软骨侵袭模型，属于肿瘤侵袭转移体外实验模型技术领域。
背景技术：
目前，喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。由于喉部周围有致密的结缔组织膜包围，静脉化疗药物很难达到病灶，经多年临床观察放疗的疗效亦不佳，因此目前喉癌的治疗仍以手术切除为主。然而由于喉部具有重要的生理功能，部分患者术后的呼吸、吞咽和发声等功能受到严重影响，给生活带来诸多不便。尽管如此，仍有部分患者死于复发和转移。喉癌中绝大部分属于鳞状细胞癌，其发病率逐年上升，成为危害人类健康的重大疾病之一。喉鳞癌早期治疗效果好，喉功能可保留，且5年生存率可高达90%。但临床上常发现存在周围组织浸润，尤其是侵袭累及喉软骨的病例很容易出现转移和复发，喉鳞癌一旦复发治疗效果则很差，5年生存率常低与60%。因此，建立喉鳞癌软骨侵袭模型，探讨喉鳞癌对软骨的侵袭机制，对预防喉鳞癌转移、复发以及选择有效的个性化治疗方案有着重要的意义。目前尚未见有关喉癌软骨侵袭模型的相关报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本发明提供一种喉鳞癌软骨侵袭模型，能有效的解决上述现有技术存在的问题。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是公开一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。作为优选，所述喉鳞癌侵袭体外实验模型的构建方法为 第一步以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；
第二步人工重建基底膜Matrigel按1 5比例用无血清RPMI-1640稀释后取100 μ L 均勻地涂在滤膜上；
第三步待Matrigel形成凝胶状后，将Transwel 1小室放入M孔板细胞培养孔中，用紫外线照射2 h杀菌备用；
第四步下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基，喉鳞癌H印-2细胞均勻加入上室，37 °C条件下培养Mh ；
第五步培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色； 第六步光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。作为优选，所述喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型的构建方法为
第一步取裸鼠喉软骨置于Transwell小室下层与10%小牛血清的RPMI1640培养基共培养；第二步各实验组喉鳞癌ifep-2细胞置上层；
第三步培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色； 第四步光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。 作为优选，所述喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型的构建方法为 第一步将喉鳞癌Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下； 第二步观察不同模型移植瘤生长情况，定时记录移植瘤体积和裸鼠体重的变化； 第三步裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，连同耳廓软骨及瘤体组织一并取
下；
第四步经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5 μ m，50°C蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50°C烘箱内烤片
第五步通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察喉鳞癌Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。与现有技术相比，该发明带来的有益效果为该发明能够有效的建立喉鳞癌软骨侵袭模型，探讨喉鳞癌对软骨的侵袭机制，对预防喉鳞癌转移、复发以及选择有效的个性化治疗方案起到极大作用。
图1为本发明喉鳞癌细胞Transwel 1小室穿膜情况； 图2为Transwel 1小室半离体侵袭试验模型。
具体实施例方式下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细说明。作为本发明的一种实施例，该喉鳞癌软骨侵袭模型包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。其中，所述喉鳞癌侵袭体外实验模型的构建方法为 第一步以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；
第二步人工重建基底膜Matrigel按1 5比例用无血清RPMI-1640稀释后取100 μ L 均勻地涂在滤膜上；
第三步待Matrigel形成凝胶状后，将Transwel 1小室放入M孔板细胞培养孔中，用紫外线照射2 h杀菌备用；
第四步下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基，喉鳞癌H印-2细胞均勻加入上室，37 °C条件下培养Mh ；
第五步培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色； 第六步光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。如图1所示，图1为本发明喉鳞癌细胞Transwell小室穿膜情况。如图2所示，其中，所述喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型的构建方法为第一步取裸鼠喉软骨置于Transwell小室下层与10%小牛血清的RPMI1640培养基共培养；
第二步各实验组喉鳞癌H印-2细胞置上层；图2为Transwell小室半离体侵袭试验模型的示意图。第三步培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第四步光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。其中，所述喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型的构建方法为 第一步将喉鳞癌Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下；
第二步观察不同模型移植瘤生长情况，定时记录移植瘤体积和裸鼠体重的变化； 第三步裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，连同耳廓软骨及瘤体组织一并取
下；
第四步经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5 μ m，50°C蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50°C烘箱内烤片
第五步通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察喉鳞癌Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。实施例1 饲养裸鼠，将H印-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下，种植喉鳞癌Hep-2 细胞使之生长，复制喉癌裸鼠动物模型。实验组每日观察肿瘤，治疗过程中裸鼠置层流架中继续饲养到实验设计时间。实验过程中，每天定时观察各组裸鼠精神状态、活动、饮食，测量其体重及瘤体积变化。裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，剥离肿瘤，测量净体积及重量，取部分肿瘤组织置于液氮保存，其余制成蜡块备用。电镜观察肿瘤超微结构变化，检测肿瘤血管生成情况的变化。连同耳廓软骨及瘤体组织一并取下，经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5 ym，5(TC蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50°C烘箱内烤片备用。进一步通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。以上对本发明所提供的喉鳞癌软骨侵袭模型进行了详尽介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式
及应用范围上均会有改变之处，对本发明的变更和改进将是可能的，而不会超出附加权利要求所规定的构思和范围，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1.一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。
2.根据权利要求1所述的一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于所述喉鳞癌侵袭体外实验模型的构建方法为第一步以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；第二步人工重建基底膜Matrigel，按1 5比例用无血清RPMI-1640稀释后取 100 μ L均勻地涂在滤膜上；第三步待Matrigel形成凝胶状后，将Transwel 1小室放入M孔板细胞培养孔中，用紫外线照射2 h杀菌备用；第四步下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基，喉鳞癌H印-2细胞均勻加入上室，37 °C条件下培养Mh;第五步培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色； 第六步光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
3.根据权利要求1所述的一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于所述喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型的构建方法为第一步取裸鼠喉软骨置于Transwell小室下层与10%小牛血清的RPMI1640培养基共培养；第二步各实验组喉鳞癌ifep-2细胞置上层；第三步培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色； 第四步光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
4.根据权利要求1所述的一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于所述喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型的构建方法为第一步将喉鳞癌Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下；第二步观察不同模型移植瘤生长情况，定时记录移植瘤体积和裸鼠体重的变化；第三步裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，连同耳廓软骨及瘤体组织一并取下；第四步经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5 μ m，50°C蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50°C烘箱内烤片第五步通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察喉鳞癌Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。
全文摘要
本发明公开了一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；人工重建基底膜Matrigel涂在滤膜上；待Matrigel形成凝胶状后，将Transwell小室放入培养孔中，用紫外线照射2h杀菌备用；下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基，喉鳞癌Hep-2细胞均匀加入上室，培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。该发明能够有效的建立喉鳞癌软骨侵袭模型，探讨喉鳞癌对软骨的侵袭机制，对预防喉鳞癌转移、复发以及选择有效的个性化治疗方案起到极大作用。
文档编号C12N5/09GK102181397SQ201110039718
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者刘世喜, 吴江, 杨慧, 邹剑, 陈飞 申请人:四川大学华西医院