具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架及其制备方法，属于假体材料领域。本发明自上而下依次由软骨层、钙化层和软骨下骨层组成，软骨层是丝素蛋白溶液经定向结晶、冻干而成的垂直取向性支架；钙化层为丝素蛋白和羟基磷灰石构成的致密区域，钙化层与软骨层、软骨下骨层之间为一次冻干成形的有机连接；软骨下骨层是由丝素蛋白和羟基磷灰石构成，经石蜡微球制孔、冻干、脱蜡而成的三维多孔结构支架。本发明具有良好的生物相容性和可降解性，钙化层与软骨层及软骨下骨层之间有机连接，起到隔离骨、软骨微环境作用，利于种植的细胞在两种微环境下更好的分化增殖，且制备技术可控性强，无需其它交联剂或有毒试剂，应用潜力巨大。
【专利说明】具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于假体材料领域，具体涉及一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 由创伤、疾病、退变等原因造成的关节部位骨软骨损伤是骨科临床常见疾病，在我 国尤为多见，且呈逐年上升趋势。目前对于这种软骨合并软骨下骨的损伤治疗困难，效果尚 不能令人满意，亟需研究理想的永久性修复重建措施，保守治疗只能暂时缓解疼痛，不能阻 止疾病的发展；自体骨软骨移植术来源有限，难以修复较大面积的缺损；异体骨软骨移植 术存在免疫排斥反应和传播疾病的可能；人工关节置换术费用昂贵，翻修率较高。组织工程 技术的迅速发展，为关节骨软骨损伤的再生修复提供了新的解决方案。
[0003] 曾有采用两种不同支架材料分别构建组织工程骨、软骨组织，然后组装到一起的 方法构建组织工程骨一软骨复合体。组装的方法包括纤维蛋白凝胶粘合、无创伤缝线缝合 方法或者聚乳酸棒粘合固定等，但是构建出的骨一软骨复合体存在骨、软骨部分结合欠佳 的问题。
[0004] 组织工程学是涉及细胞生物学、材料科学、工程学以及生物反应器的一门交叉学 科，利用生命科学和工程学的基本原理和方法，构建人体所需要组织，用于修复、替代因创 伤、疾病而无功能的组织或器官。组织工程研究的主要内容包括：种子细胞、支架材料、生长 因子。种子细胞包括软骨细胞、骨髓基质干细胞、脂肪源性干细胞以及经过基因工程改造的 细胞等。目前国内外关于组织工程骨-软骨的研究主要集中于支架材料和种子细胞的选取 以及成骨和成软骨部分的连接方式等方面， 中国专利申请201010140115. 2公开了"一种双层仿生软骨组织工程用支架制备方 法"。首先制备衬底，再在衬底表面制得双层仿生软骨支架，最后通过NaOH溶液浸润衬底表 面的双层仿生软骨支架，从衬底上剥离即得到双层仿生软骨支架，本发明制备的双层仿生 软骨支架厚度薄，力学性能良好，一次成型，垂直孔与圆形孔之间连接紧密，不存在相互脱 离的问题；支架结构接近天然软骨结构，软骨支架可直接与含聚乳酸PLA/骨粉的衬底结合 形成骨软骨支架，用于骨软骨同时缺损的修复，软骨层部分依然具有双层结构。
[0005] 中国专利申请201210088049. 8公开了一种"一种组织工程软骨支架材料及其制 备方法和装置"。本发明的软骨支架材料由上至下依次为表层、中层和钙化层；表层由冻干 软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、GAG、X型 胶原和II型胶原及TGF-β组成，基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型 胶原及煅烧骨粉组成，其纤维呈三维交错分布。有利于支架材料植入后与软骨下骨的融合， 促进软骨下骨的再生；在复合软骨细胞后，能够用于全层软骨缺损修复，再生的软骨组织具 有与天然软骨一致的空间结构和蛋白组分；适于膝关节等负重部位关节软骨的修复，再生 抗压强度较大的新生软骨，提高软骨支架表面的耐磨性和抗压能力。
【发明内容】
[0006] 本发明是为了克服现有技术中存在的骨和软骨部分结合欠佳的缺点而提出的，其 目的是提供一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架及其制备方法。
[0007] 本发明的技术方案是： 一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，所述支架自上而下依次由软骨层1、钙化 层2和软骨下骨层3组成，所述软骨层1为丝素蛋白构成的垂直取向性支架，所述钙化层2 为丝素蛋白和羟基磷灰石构成的致密区域，所述软骨下骨层3为丝素蛋白和羟基磷灰石构 成的三维多孔结构支架；钙化层2与软骨层1、软骨下骨层3之间有机连接。
[0008] 所述钙化层2和软骨下骨层3中的丝素蛋白与羟基磷灰石的质量比例均为1:1。
[0009] 所述软骨下骨层3的三维多孔结构的孔径范围为250 μ πΓ425 μ m。
[0010] 所述钙化层2的厚度小于500 μ m。
[0011] 所述软骨层1与软骨下骨层3的厚度比例为1 :1。
[0012] 一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的制备方法，包括以下步骤： a. 石蜡微球模板制备 将石蜡微球放入聚乙烯模具中，烘干备用； b. 钙化层2和软骨下骨层3的制备 将质量分数为10%丝素蛋白溶液和10%羟基磷灰石溶液按质量比1:1的混匀，加入石 蜡微球模板中，抽吸真空，混合液充分填充，且高出石蜡微球模板一定距离，液氮冷却后，室 温静置； c. 软骨层1的制备 待钙化层2表面微融后，将质量分数为6%的丝素蛋白溶液2mL缓慢加入模具中的钙化 层2上，-80°C冷冻干燥成型； d. 丝素变构和脱蜡 成型后从聚乙烯模具中取出，无水乙醇浸泡，滤蜡，晾干，即得骨软骨支架。
[0013] 所述丝素蛋白溶液的制备包括以下步骤： ① 蚕丝脱胶：按质量比1:200将天然蚕丝加入0. 02mol/L的Na2C03溶液中，煮沸，反复 水洗，更换Na2C0 3溶液后重复煮沸、水洗，然后通风晾干，得丝素丝； ② 丝素丝溶解液：按质量比1:4将丝素丝加入0. 8g/mL的溴化锂溶液中，60°C水浴中 磁力搅拌获得； ③ 透析脱盐：将丝素丝溶解液倒入截留分子量为1200(Γ14000的透析袋中，透析3天， 每天换水，离心，取上清，转入截留分子量为3500的透析袋中，经质量分数15%的聚乙二醇 溶液中透析，离心取上清即得； 所述石蜡微球的制备包括以下步骤： ① 配制质量分数为5%的聚乙烯醇溶液，加热融化； ② 称取60g石蜡块，切碎，加入1080ml蒸馏水中，再加入120ml质量分数为5%聚乙烯 醇，加热搅拌，冷却，2(Γ80目筛网依次叠放，过筛； ③ 筛得石蜡微球用水反复冲洗，酒精除水、晾干，取4(Γ60目石蜡微球备用。
[0014] 所述滤蜡技术应用索氏提取器，溶剂为正己烷或者环己烷。
[0015] 本发明的有益效果是： 本发明中构建了一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，使其结构更接近于生理 环境，是一种骨软骨复合组织再生和重建领域的新模式，为构建组织工程骨软骨复合物提 供了新思路，给进一步临床应用提供实验依据。所采用的材料属于天然材料，具有良好的生 物相容性和可降解性，而且材料来源广泛。钙化层与软骨层及软骨下骨层有机连接，即利用 未发生构象转变的丝素溶液本身互溶，可以将骨-软骨两部分支架很好的连接起来，同时 制备连接钙化层，起到隔离骨、软骨微环境作用，利于种植的细胞在两种微环境下更好的分 化增殖。同时该支架制备技术可控性强，无需其它交联剂或有毒试剂，应用潜力巨大。本发 明在成分、形态、力学特性上接近于人体关节的"透明软骨-界面结构-软骨下骨"细胞外 基质结构，并且结合紧密避免分层。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是本发明的结构示意图； 图2是扫描电镜观察下的本发明结构图； 图3是扫描电镜观察下的软骨层纵切面图； 图4是扫描电镜观察下的软骨层横截面图； 图5是扫描电镜观察下的软骨下骨层图； 图6是本发明中软骨部分HE染色图； 图7是本发明中软骨下骨部分HE染色图； 图8是本发明中软骨部分甲苯胺蓝染色图； 图9是本发明中软骨下骨部分钙结节染色图； 图10是扫描电镜下细胞粘附在软骨支架取向微孔结构表面图； 图11是扫描电镜下细胞充盈在软骨下骨支架孔隙中的结构图； 图12是LIVE/DEAD染色显示细胞充盈于软骨支架取向结构中的结构图； 图13是LIVE/DEAD染色显示细胞粘附于软骨支架微孔结构图； 图14是LIVE/DEAD染色显示细胞充盈于软骨下骨支架孔隙中结构图。
[0017] 其中： 1.软骨层 2.钙化层 3.软骨下骨层。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合说明书附图及实施例对本发明进行详细说明： 如图1所示，一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，所述支架自上而下依次由 软骨层1、钙化层2和软骨下骨层3组成，所述软骨层1为丝素蛋白构成的垂直取向性支架； 所述钙化层2为丝素蛋白和羟基磷灰石构成的致密区域，钙化层2与软骨层1、软骨下骨层 3之间有机连接；所述软骨下骨层3为丝素蛋白和羟基磷灰石构成的三维多孔结构支架。
[0019] 所述的软骨层1为6%的丝素蛋白溶液经定向结晶、冻干而成。
[0020] 所述钙化层2和软骨下骨层3中的丝素蛋白与羟基磷灰石的质量比例均为1: 1，钙 化层2与软骨层1、软骨下骨层3 -次冻干成形。所述钙化层2的厚度小于500 μ m。
[0021] 所述软骨下骨层3的三维多孔结构的孔径范围为250 μ πΓ425 μ m，软骨下骨层3采 用石蜡微球制孔的方法，经冻干、脱蜡即得。
[0022] 所述软骨层1与软骨下骨层3的厚度比例为1:1。
[0023] -种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的制备方法，包括以下步骤： a. 石蜡微球模板制备 将0. 5g 4(Γ60目的石蜡微球置于聚乙烯模具中，轻轻压平，置于55°C烤箱70min融固， 室温冷却； b. 钙化层2和软骨下骨层3的制备 分别取质量分数均为10%丝素蛋白溶液和羟基磷灰石溶液各lg混匀，滴加到盛有石蜡 微球的聚乙烯模具中，真空抽吸，使混合液充盈到石蜡微球之间，吸去多余液体，仅留石蜡 微球表面薄层，即混合液高出石蜡微球模板300 μ m，液氮冷却后，室温静置20min ; c. 软骨层1的制备 待钙化层2表面微融后，将质量分数为6%的丝素蛋白溶液轻轻滴到丝素蛋白溶液和羟 基磷灰石混合液上面，高度以滴满模具为宜，约2mL ;将已经-80°C冷却的金属块放在模具 上，水平放置于_80°C冰箱中过夜，冻干； d. 丝素变构和脱蜡 将冻干的支架从聚乙烯模具中取出，无水乙醇浸泡2h，晾干后放到盛有环己烷的索氏 提取器中滤蜡48h，脱去石蜡，晾干即得。
[0024] 其中所述石蜡微球的制备包括以下步骤： ① 配制质量分数为5%的聚乙烯醇溶液，加热融化2h ; ② 称取60g石蜡块，切碎，加入1080ml蒸馏水中，再加入120ml质量分数为5%聚乙烯 醇溶液，加热搅拌，冷却过筛，筛网大小从20目~80目依次叠放； ③ 将筛网中的石蜡微球用自来水反复冲洗，酒精除水、晾干，按大小分类包装，取4(Γ60 目石蜡微球备用。
[0025] 其中所述质量分数均为10%的丝素蛋白溶液的制备包括以下步骤： ① 蚕丝脱胶：将40g天然蚕丝加入8kg 0. 02mol/L的Na2C03溶液中，煮沸30min,蒸馈 水洗10次，更换Na 2C03溶液，重复上述操作，清洗后置于通风处晾干，即得丝素丝； ② 丝素丝溶解：称取8〇g溴化锂定容蒸馏水100ml溶解，称取晾干的丝素丝20g，缓慢 塞入溴化锂溶液中，60°C水浴磁力搅拌4h ; ③ 透析脱盐：将丝素丝溶解液倒入截留分子量为13000的透析袋中，透析3天，每天更 换蒸馈水3次，llOOOrpm离心15min，取上清，倒入截留分子量为3500的透析袋中，于质量 分数15%的聚乙二醇溶液中透析10h，llOOOrpm离心15min，取上清即为丝素蛋白溶液； ④ 丝素蛋白溶液浓度测量：准确量取5组lml丝素蛋白溶液，置于培养皿中，55°C干燥 过夜，用分析天平准确测量空培养皿、干燥前和干燥后培养皿的重量，计算出丝素蛋白溶液 的浓度和密度。
[0026] ⑤据丝素蛋白浓度测量结果，添加适量的蒸馏水，配制成10%的丝素蛋白溶液，搅 拌均匀； 其中10%丝素蛋白溶液和10%羟基磷灰石溶液混合液的制备方法如下： 采用纳米级羟基磷灰石，称取lkg的羟基磷灰石粉末，按照质量比1:10添加蒸馏水 l〇kg制成质量分数为10%羟基磷灰石溶液，置于摇床lh混匀；按照质量比1:1的比例，取 质量分数为10%丝素蛋白溶液和质量分数为10%羟基磷灰石溶液各lkg混合，利用超声振 荡器将二者结合在一起，即得10%丝素蛋白溶液和10%羟基磷灰石溶液混合液。
[0027] 本发明中具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的体式显微镜、扫描电镜检测： 图2是扫描电镜观察下（X100)的本发明结构图，如图2所示，本发明一体化支架体式 显微镜下观察3部分层次明显，一体化支架钙化层2明显，软骨层1与钙化层2、钙化层2与 软骨下骨层3之间连接紧密。
[0028] 图3是扫描电镜观察下（X500)的软骨层纵切面图，图4是扫描电镜观察下 (X 500)的软骨层横截面图。
[0029] 如图3、4所示，软骨层具有明显的仿生取向微孔结构，分布均匀； 图5是扫描电镜观察下（X 250)的软骨下骨层图，如图5所示，软骨下骨层3具有良好 的三维多孔结构，孔隙均匀，连通性好。
[0030] 本发明具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的生物相容性： 将脂肪干细胞分别向软骨以及成骨诱导后，分别种植到支架的软骨、软骨下骨部分，经 病理组织学染色、扫描电镜、LIVE/DEAD染色观察。
[0031] 图6是本发明中软骨部分HE染色图（X 200)，图7是本发明中软骨下骨部分HE染 色图（X 100)，图8是本发明中软骨部分甲苯胺蓝染色图，图9是本发明中软骨下骨部分钙 结节染色图（X 100)。
[0032] 如图6、所示，组织学染色显示经诱导的脂肪干细胞均匀粘附于支架的孔隙中， 软骨细胞呈球形，分泌大量蛋白多糖等基质，成骨细胞呈梭形，有大量钙结节沉积。
[0033] 图10是扫描电镜下（X 1000)细胞粘附在软骨支架取向微孔结构表面图，图11是 扫描电镜下（X 500)细胞充盈在软骨下骨支架孔隙中的结构图。
[0034] 如图10、11所示，扫描电镜观察，细胞均匀粘附在支架上； 图12是LIVE/DEAD染色显示细胞充盈于软骨支架取向结构中的结构图，图13是LIVE/ DEAD染色显示细胞粘附于软骨支架微孔结构图，图14是LIVE/DEAD染色显示细胞充盈于软 骨下骨支架孔隙中结构图。
[0035] 如图12~14所示，LIVE/DEAD染色观察（X 200)，经诱导的脂肪干细胞分别在软骨 支架和软骨下骨支架上呈绿色荧光，代表细胞存活良好。
[0036] 本发明的主要优点如下： ①提出了根据仿生学原理模拟关节的"透明软骨-界面结构-软骨下骨"天然结构， 研制"骨支架-界面结构-软骨支架"的设计理念；并提出利用未发生构象转变的SF溶液 本身互溶，将三部分支架紧密连接，既隔离了骨、软骨微环境，又加强了软骨、骨部分的力学 强度。
[0037] ②软骨层1为仿生取向微孔结构，软骨下骨层3具备高贯通性和孔隙率的 Macro-micro结构，界面结构组成类似于天然软骨興化层2,使其结构功能更接近于生理， 是一种骨-软骨复合组织再生和重建领域的新模式。
[0038] ③软骨层1、软骨下骨层3具有良好的孔隙结构和连通性，有利于细胞迁移入支架 内部及营养物质和代谢产物的转移。
【权利要求】
1. 一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，其特征在于：所述支架自上而下依次 由软骨层（1)、钙化层（2)和软骨下骨层（3)组成，所述软骨层（1)为丝素蛋白构成的垂直取 向性支架，所述钙化层（2)为丝素蛋白和羟基磷灰石构成的致密区域，所述软骨下骨层（3) 为丝素蛋白和羟基磷灰石构成的三维多孔结构支架；钙化层（2)与软骨层（1)、软骨下骨层 (3)之间有机连接。
2. 根据权利要求1所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，其特征在于： 所述钙化层（2 )和软骨下骨层（3 )中的丝素蛋白与羟基磷灰石的质量比例均为1:1。
3. 根据权利要求1所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，其特征在于： 所述软骨下骨层（3)的三维多孔结构的孔径范围为250 μ πΓ425 μ m。
4. 根据权利要求1所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，其特征在于： 所述钙化层（2)的厚度小于500 μ m。
5. 根据权利要求1所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架，其特征在于： 所述软骨层（1)与软骨下骨层（3)的厚度比例为1 :1。
6. 按照权利要求1所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的制备方法，其 特征在于：包括以下步骤： a. 石蜡微球模板制备 将石蜡微球放入聚乙烯模具中，烘干备用； b. 钙化层（2)和软骨下骨层（3)的制备 将质量分数为10%丝素蛋白溶液和10%羟基磷灰石溶液按质量比1:1的混匀，加入石 蜡微球模板中，抽吸真空，混合液充分填充，且高出石蜡微球模板一定距离，液氮冷却后，室 温静置； c. 软骨层（1)的制备 待钙化层（2)表面微融后，将质量分数为6%的丝素蛋白溶液2mL缓慢加入模具中的钙 化层（2)上，-80°C冷冻干燥成型； d. 丝素变构和脱蜡 成型后从聚乙烯模具中取出，无水乙醇浸泡，滤蜡，晾干，即得骨软骨支架。
7. 根据权利要求6所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的制备方法，其 特征在于：所述丝素蛋白溶液的制备包括以下步骤： ① 蚕丝脱胶：按质量比1:200将天然蚕丝加入0. 02mol/L的Na2C03溶液中，煮沸，反复 水洗，更换Na2C0 3溶液后重复煮沸、水洗，然后通风晾干，得丝素丝； ② 丝素丝溶解液：按质量比1:4将丝素丝加入0. 8g/mL的溴化锂溶液中，60°C水浴中 磁力搅拌获得； ③ 透析脱盐：将丝素丝溶解液倒入截留分子量为1200(Γ14000的透析袋中，透析3天， 每天换水，离心，取上清，转入截留分子量为3500的透析袋中，经质量分数15%的聚乙二醇 溶液中透析，离心取上清即得。
8. 根据权利要求6所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的制备方法，其 特征在于：所述石蜡微球的制备包括以下步骤： ① 配制质量分数为5%的聚乙烯醇溶液，加热融化； ② 称取60g石蜡块，切碎，加入1080ml蒸馏水中，再加入120ml质量分数为5%聚乙烯 醇，加热搅拌，冷却，2(Γ80目筛网依次叠放，过筛； ③筛得石蜡微球用水反复冲洗，酒精除水、晾干，取4(Γ60目石蜡微球备用。
9.根据权利要求6所述的一种具有仿生界面结构的一体化骨软骨支架的制备方法，其 特征在于：所述滤蜡技术应用索氏提取器，溶剂为正己烷或者环己烷。
【文档编号】A61L27/56GK104117097SQ201410397070
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】杨强, 徐宝山, 丁晓明, 马信龙, 赵艳红, 王连永 申请人:天津市天津医院