本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种水通道蛋白5(aqp5)在制备检测先天性白内障基因诊断制品中的应用。
发明背景
先天性白内障(congenitalcataract)是导致儿童低视力和盲的常见眼病，发病率约为0.01％-0.06％，白内障能导致婴幼儿失明或弱视，失明儿童中有22％～30％为白内障所致，是一组严重的致盲疾病，严重影响儿童的视力发育，已成为儿童失明的第二位原因。先天性白内障可独立发生，也可作为眼部或全身综合征的伴发症状，常累及双眼，常伴发眼前节发育不良，如虹膜缺损、peters异常、瞳孔异位及眼球震颤等，这些多发畸形常使大多数患者丧失视力，是先天性致盲的重要原因之一。该病目前尚缺乏有效的治疗手段，因此严重影响着患者的生活质量，给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担。
迄今为止，已经发现200多个基因和位点与先天性白内障相关，先天性白内障基因/位点的鉴定对揭示先天性白内障疾病的致病机理及研究其防治措施具有重要意义。与先天性白内障相关的基因编码的蛋白涉及到晶状体蛋白、转录因子、连接蛋白及跨膜转运蛋白等。国内外的遗传学研究结果表明该病很大程度上是由于遗传因素导致的。先天性白内障具有显著的遗传异质性，存在多个候选致病基因，这已经成为先天性白内障的发病机制的研究以及针对病因的诊断和治疗研究的瓶颈。这种现状促使进一步去发现和了解该病新的致病基因，为后续的基因诊断、产前诊断及基因治疗提供基础。
先天性白内障发病较早，病情逐渐进展，常双眼发病，对视力影响严重，早期治疗至关重要，但婴幼儿先天性白内障的延迟发现和治疗现象在我国十分严重，术后并发症多并且容易复发，加之手术费用昂贵，给患者家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。建立先天性白内障的相关的基因突变检测系统，并应用于临床工作和优生优育，有助于遗传性先天性白内障的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾病的发生。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种aqp5基因在制备检测先天性白内障诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。
申请人从一个5代呈常染色体显性遗传的先天性白内障家系中，对该家系全部成员进行了aqp5基因的测序，找到了该家系的致病基因aqp5存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。
本发明首先提供aqp5基因新的用途，是在制备用于检测先天性白内障诊断制品中的应用；
上述的诊断制品，作为实施例的优选，是检测先天性白内障的引物或探针。
上述的引物对，其引物信息如下：
aqp5-1f:ctatatagcgcgccccagseqidno:1、
aqp5-1r:gcaggaagggagcacatatcseqidno:2、
aqp5-2f:aaaagccctactccccgagseqidno:3、
aqp5-2r:tatttgccttgagtgcctgcseqidno:4、
aqp5-3f:attctgtgggagtggaccagseqidno:5、
aqp5-3r:ccaggtctggtgagctctgseqidno:6、
aqp5-4f:ggcatgtggtcttcaaggtcseqidno:7、
aqp5-4r:ccaagaggaccggttgtgseqidno:8；
本发明还提供一种用于检测先天性白内障的试剂盒，包含有上述的引物对中的两种或几种。
本发明还提供一种与先天性白内障疾病相关的snp位点，为aqp5基因起始密码子起第152位的碱基。
其中用于检测上述snp位点的引物信息如下：
aqp5-1f:ctatatagcgcgccccagseqidno:1
aqp5-1r:gcaggaagggagcacatatcseqidno:2。
本发明提供了aqp5基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性白内障疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的snp位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行aqp5基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1：实施例1的先天性白内障家系内患者aqp5测序图，a：参考序列；b：先证者序列。该家系中9名患者aqp5基因起始密码子起第152位的碱基t突变为c。
具体实施方式
申请人在一个先天性白内障家系中发现aqp5基因的突变位点，并证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。
aqp5基因位于染色体12q13.12，可转录成大约1840bp的mrna(ncbi登录号为nm_001651)，直接翻译形成265个氨基酸组成的蛋白质。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：从先天性白内障家系中筛选aqp5基因的突变位点
1、提取外周血基因组dna：
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取家系成员外周静脉血2-5ml，放入edta抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的edta抗凝血在室温融化后，取500μl放于离心管，加入等体积te(ph8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。
加入180μlte、20μlsds(10％)、8μl蛋白酶k(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的tris-饱和酚(约300μl)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μl)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。
加入等体积的tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入等体积的tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μl)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入l/10体积3mol/l、ph5.2醋酸钠(约30μl)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使dna沉淀于管底，弃上清。
向dna沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μlte(ph8.0)，4℃过夜溶解dna。
对提取的dna行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测dna纯度及浓度。
2、直接测序法寻找该家系内患者aqp5基因的突变
pcr扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)pcr反应条件：94℃3min；94℃40sec，52℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。
(2)反应体系：(takaralataqpolymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组dna模板与该aqp5引物的扩增反应。
pcr产物测序：应用常规sanger测序法对上述pcr产物进行测序，其中应用引物对aqp5-1f:ctatatagcgcgccccag,aqp5-1r:gcaggaagggagcacatatc，在该家系中九名患者aqp5基因起始密码子起第152位的碱基t突变为c(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。该突变为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，该突变导致了aqp5蛋白第51位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸。应用点突变预测程序sift(sortingintolerantfromtolerant)预测发现，该突变导致了aqp5蛋白功能“damaging”级的损坏；应用点突变预测程序polyphen(thepolymorphismphenotype)预测发现，该突变导致了aqp5蛋白功能“possiblydamaging”级的损坏；从而引起了该家系中患者先天性白内障的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组dna样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
通过上述的分析，证明aqp5基因可以用来检测患者是否具有潜在患先天性白内障的危险。通过将检测者的aqp5基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。
根据aqp5的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：
aqp5-1f:ctatatagcgcgccccag
aqp5-1r:gcaggaagggagcacatatc
aqp5-2f:aaaagccctactccccgag
aqp5-2r:tatttgccttgagtgcctgc
aqp5-3f:attctgtgggagtggaccag
aqp5-3r:ccaggtctggtgagctctg
aqp5-4f:ggcatgtggtcttcaaggtc
aqp5-4r:ccaagaggaccggttgtg
分别应用上述的每一对引物进行aqp5基因的检测。
另在山东地区收集诊断明确的先天性白内障散发患者一名，提取其外周血基因组dna，应用该患者的dna模板与aqp5-1f和aqp5-1r引物进行pcr扩增，应用常规sanger测序法对上述pcr产物进行测序，该患者的aqp5基因存在本发明中发现的snp突变，即aqp5基因起始密码子起第152位的碱基t突变为c。通过上述的分析，证明aqp5基因可以用来检测患者是否具有潜在患先天性白内障的危险。通过将检测者的aqp5基因的扩增片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。
sequencelisting
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