本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种以豆渣为主要原料制备赤藓醇的方法。
背景技术：
赤藓醇又名1,2,3,4-丁糖醇，是一种低热量甜味剂，其热量值仅为0.3kcal/g，远低于其他甜味剂，而其甜度能达到蔗糖的70~80%，因此是最理想的肥胖病患者的膳食添加剂。赤藓醇不能为人体代谢，摄入的90%的赤藓醇不会被吸收而是随尿液直接排出体外，因此升糖指数极低，适于糖尿病及心血管疾病患者食用。此外，赤藓醇不能被引起龋齿的细菌利用，在口腔护理中可取代木糖醇。而动物毒理学和临床研究中已证明赤藓醇是安全的甜味剂。基于以上属性，赤藓醇已被广泛应用于特殊功能食品加工，在食品卫生保健中的需求日益增长。截至2011年，世界赤藓醇年需求量已超过46000吨，其每吨的市场价格达到4000美元，具有极高的经济价值。赤藓醇多以发酵法获取，其中，以解脂耶氏酵母（yarrowialipolytica）利用葡萄糖或甘油发酵产赤藓醇最为常见。然而葡萄糖及甘油本身价格较高，导致赤藓醇价格昂贵，市场认知度较低。因此，亟需寻找一条低成本的赤藓醇发酵工艺。
豆渣是豆制品如豆腐、豆浆、腐乳及其它豆制品生产过程中的主要废弃物。全世界豆制品加工厂每年大概要产生1400万吨的豆渣废弃物。豆渣营养丰富，干豆渣主要成分是蛋白质18~23%，脂肪12~13%，灰分2.76%，粗纤维50~55%及可溶性膳食纤维6.55%，是良好的微生物生长底物。豆渣价格低廉，但目前对豆渣处理尚无有效方法，很大一部分被随意丢弃，仅有少部分被用作饲料、肥料或膳食纤维的提取。由于鲜豆渣含水量高，极易滋生微生物，造成极大的环境污染及资源浪费，因此寻找一条合理有效的豆渣处理方式迫在眉睫。
y.lipolytica菌株能够产生高活力的蛋白酶及脂肪酶，能够充分利用豆渣中的蛋白质、脂肪及可溶性糖，因此豆渣可作为y.lipolytica发酵的优良天然底物。vang等在internationaljournaloffoodmicrobiology（2016，235：1–9）发表的“okara(soybeanresidue)biotransformationbyyeastyarrowialipolytica”论述了y.lipolytica以豆渣为原料发酵各种有机酸及醇醛类物质等。然而目前，以豆渣作为y.lipolytica发酵原料尚存在两个弊端：一、y.lipolytica不具分泌纤维素酶的能力，不能水解豆渣的主要成分纤维素，因而难以实现豆渣的充分水解及利用，极易超成二次污染；二、豆渣中的高蛋白含量导致碳氮比过高，不利于微生物发酵中产物合成。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种以豆渣为主要原料制备赤藓醇的方法。首先，利用雅致放射毛霉（a.elegans）对豆渣进行预发酵，水解其中大分子物质，增加其可利用性；同时严格控制预发酵时间，尽量减少a.elegans对豆渣的利用，使水解后的营养物质得以最大程度的保留。而后，以y.lipolytica为赤藓醇发酵菌株、预处理豆渣作为唯一基质进行赤藓醇液态发酵。通过调控发酵过程ph，促进y.lipolytica自身酸性蛋白酶分泌，进一步水解豆渣蛋白，从而提高发酵体系中的碳氮比，实现此发酵体系中赤藓醇的高效生成。本发明方法可避免豆渣利用过程中的底物利用率低及高碳氮比造成的产物产率低下问题，提高赤藓醇产率，同时增加豆渣的经济效益。
一种以豆渣为主要原料制备赤藓醇的方法，具体步骤包括以下几个方面：
1、豆渣含水量调控：豆渣烘干脱水后，通过添加蒸馏水，控制其预发酵湿度，制成豆渣培养基。其中，步骤1中添加的水分含量在30%~80%，优选为60%。
2、豆渣预发酵：上述豆渣培养基中接入a.elegans孢子，充分混匀后静置发酵，发酵结束灭菌烘干备用。其中，步骤2中所用的毛霉菌株为腐乳制造业常用的雅致放射毛霉（actinomucorelegans），保藏号cgmccno.3.2927。在pda斜面上活化后，以四层纱布过滤得孢子，甘油管保存待用。
步骤2中所述的毛霉接种量为1×105~1×1010个细胞/100克干豆渣，优选为1×108个细胞/100克干豆渣。
步骤2中所述的豆渣预发酵温度为26~32℃，优选为30℃。
步骤2中所述预发酵天数为3~15天，优选为5天。
步骤2中所述灭菌条件为115℃灭菌30分钟，于60℃下烘干。
3、赤藓醇发酵培养基确定：将所得预发酵干豆渣用于赤藓醇液体发酵，确定最适碳源添加量、最佳渗透压调节剂及其添加量。
步骤3中，预发酵干豆渣的添加量为20.0~80.0g/l，优选为30.0g/l。步骤3中，以氯化钠和氯化钾为渗透压调节剂，优选为氯化钠；添加浓度为0~100g/l，优选为40g/l；
步骤3中，以预处理豆渣为原料的赤藓醇发酵培养基中，无需额外添加其他营养元素。
4、赤藓醇发酵：在上述培养基中接入y.lipolytica细胞，控制培养基ph，在一定条件下培养一段时间后，采用hplc法测定发酵液中的赤藓醇产量。
步骤4中所述的赤藓醇发酵菌株y.lipolytica为解脂耶氏酵母yarrowialipolytica，菌种编号为cgmcc2.1207。
步骤4中所述的y.lipolytica接种量为1×106~1×109个细胞/升培养基，优选为1×108个细胞/升培养基。
步骤4中，ph调控策略为：发酵初始阶段（24h~60h），通过流加1mhcl控制发酵ph为2.0~4.0，优选为在发酵48h内控制ph维持在3.0。发酵后续阶段，通过流加1mkoh溶液控制发酵ph为3.0~6.0，优选为ph5.0。
步骤4中所述发酵条件为：发酵温度为26～30℃，优选为28℃。通入空气控制发酵溶氧为30~50％，优选为40%。搅拌转速为200～300rpm，优选为250rpm。培养120～168h，至培养基中赤藓醇含量不再上升发酵结束。
本发明有益效果：本发明通过提出的技术解决方案的工艺路线和实施步骤，由于豆渣价格低廉，以之为原料可显著降低发酵成本。豆渣营养丰富，因此发酵过程中无需额外添加营养物质，进一步降低了赤藓醇发酵成本。霉菌预发酵可大大提高豆渣的利用率，进而通过ph调控，提高发酵过程中碳氮比，促进赤藓醇合成，避免了资源浪费及二次污染，提高了豆渣的产出值。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种以豆渣为主要原料制备赤藓醇的方法，下面将具体进行说明。
实施例1
1、豆渣烘干脱水后，通过添加蒸馏水，控制其水分含量在60%。按接种量为1×108个细胞/100克干豆渣接入a.elegans孢子，充分混匀，在30℃下发酵5天，预发酵完成后于115℃灭菌30分钟后，于60℃下烘干。
2、预发酵干豆渣添加量为30.0g/l，以氯化钾为渗透压调节剂，添加浓度为20g/l。接种量为1×106个细胞/升培养基；培养温度26℃；搅拌速度140rpm；发酵过程不调节ph。测定赤藓醇产量为0.41g/g预发酵豆渣。
实施例2
1、豆渣烘干脱水后，通过添加蒸馏水，控制其水分含量在30%。按接种量为1×105个细胞/100克干豆渣接入a.elegans孢子，充分混匀，在26℃下发酵3天，预发酵完成后于115℃灭菌30分钟后，于60℃下烘干。
2、预发酵干豆渣添加量为30.0g/l，以氯化钠为渗透压调节剂，添加浓度为40g/l；接种量为1×108个细胞/升培养基的y.lipolytica细胞浓度；培养温度30℃；搅拌速度200rpm；发酵过程控制ph始终为3.0。测定赤藓醇产量为0.30g/g预发酵豆渣。
实施例3
1、豆渣烘干脱水后，通过添加蒸馏水，控制其水分含量在30%。按接种量为1×105个细胞每100克干豆渣接入a.elegans孢子，充分混匀，在26℃下发酵3天，预发酵完成后于115℃灭菌30分钟后，于60℃下烘干。
2、预发酵干豆渣添加量为30.0g/l，以氯化钠为渗透压调节剂，添加浓度为40g/l；接种量为1×108个细胞每升培养基的y.lipolytica细胞浓度；培养温度30℃；搅拌速度200rpm；发酵前48h调控ph为3.0，48h以后调为ph5.0。测定赤藓醇产量为0.39g/g预发酵豆渣。
实施例4
1、豆渣烘干脱水后，通过添加蒸馏水，控制其水分含量在60%。按接种量为1×108个细胞每100克干豆渣接入a.elegans孢子，充分混匀，在30℃下发酵5天，预发酵完成后于115℃灭菌30分钟后，于60℃下烘干。
2、预发酵干豆渣添加量为30.0g/l，以氯化钠为渗透压调节剂，添加浓度为40g/l；接种量1×108个细胞每升培养基的y.lipolytica细胞浓度；培养温度30℃；搅拌速度250rpm；ph不控制。测定赤藓醇产量为0.47g/g预发酵豆渣。
实施例5
1、豆渣烘干脱水后，通过添加蒸馏水，控制其水分含量在60%。按接种量为1×108个细胞每100克干豆渣接入a.elegans孢子，充分混匀，在30℃下发酵5天，预发酵完成后于115℃灭菌30分钟后，于60℃下烘干。
2、预发酵干豆渣添加量为30.0g/l，以氯化钠为渗透压调节剂，添加浓度为40g/l；接种量1×108个细胞每升培养基的y.lipolytica细胞浓度；培养温度30℃；搅拌速度250rpm；发酵前48h调控ph为3.0，48h以后调为ph5.0。测定赤藓醇产量为0.56g/g预发酵豆渣。