PLS3重组蛋白真核表达质粒及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种pls3重组蛋白真核表达质粒及其构建方法和应用。

背景技术：

肌动蛋白成束蛋白plastin-3(pls3)是plastin蛋白家族中的一员，又被称为t-plastin，基因定位于xq23，mrna蛋白质编码区(codingsequence,cds)包括1893个核苷酸，蛋白由630个氨基酸组成。它可以与α、β、γ三种肌动蛋白结合，并在多种实体组织细胞中表达，在外周血中不表达。plastin-3在肿瘤发生和发展过程中扮演着重要角色。研究表明，plastin-3能调控调控细胞运动、肿瘤细胞的存活和迁移，并能调控肿瘤细胞对顺铂等化疗药物或uv的敏感性。除此之外，plastin-3可能是一种潜在的肿瘤标志物：它的异常表达可以作为皮肤t细胞淋巴瘤的标志物；结直肠癌循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctcs)中plastin-3的表达与结直肠癌患者的远端转移和预后相关。综上所述，plastin-3与肿瘤的发生发展密切相关，而明确plastin-3在肿瘤发生发展中的功能，对肿瘤的诊断、治疗及预后均具有非常重要的意义。

尽管plastin-3有非常重要的作用，但构建含cds全长的质粒存在一定的局限性。1996年，hisano在febsletters杂志发表的文章中采用两步扩增的方法才获得全长的cdna片段；2008年，oprea等在science杂志发表的文章中构建的plastin-3质粒只包含1-629个氨基酸序列的cdna，而plastin-3蛋白的氨基酸共包含630个氨基酸(np_005023.2)。另外，这些质粒转染真核细胞的成功与否，需要进行rna或蛋白的提取进行实时定量pcr或者westernblot的方法检测plastin-3rna或蛋白的表达情况，此方法相对较费时、繁琐。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种相对简便的方法构建肌动蛋白成束蛋白plastin-3(pls3)的真核表达载体，通过荧光报告基因能更加直观、快捷地检测真核细胞的转染效率，并为肌动蛋白成束蛋白plastin-3用于肿瘤基础研究和临床诊疗提供一种新途径。

为了实现本发明目的，本发明提供一种pls3重组蛋白真核表达质粒，其为携带含his标签的pls3重组蛋白编码基因的真核表达质粒，所述真核表达质粒还携带有荧光报告基因。

其中，所述真核表达质粒的出发质粒可以是pires2-zsgreen1、pcdna3.1、pegfp或pcmv7.1等。优选pires2-zsgreen1。

所述pls3重组蛋白为人pls3重组蛋白，其编码基因的cds序列如seqidno.1所示(不含his标签)。

本发明的pls3重组蛋白真核表达质粒可按如下方法制备得到，包括以下步骤：

(1)提取mcf-7细胞rna作为模板，以seqidno.2和seqidno.3所示的序列为引物，加入酶切位点和编码6×his的碱基序列，构建酶切位点为ecori-pls3-his-bamhi的cdna片段；

(2)分别对pires2-zsgreen1质粒和步骤(1)所述cdna片段进行ecori和bamhi双酶切，然后将酶切后的cdna片段克隆至pires2-zsgreen1质粒，构建成pires2-zsgreen1-his-pls3真核表达质粒。

通过将上述pls3重组蛋白真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，利用大肠杆菌自身机制进行质粒的扩增，可制备出大量真核表达质粒。

本发明还提供含有所述pls3重组蛋白真核表达质粒的细胞系，包括但不限于mcf-7、293t、cho-k1、t-24细胞。例如，采用上述真核表达质粒分别转染乳腺癌细胞系mcf-7和人肾上皮细胞系293t后，检测质粒的表达情况。检测结果表明，mcf-7细胞成功表达报告基因zsgreen1；转染质粒的293t细胞系高表达his标签以及plastin-3。

本发明还提供所述细胞系在以pls3蛋白为肿瘤标志物的肿瘤研究中的应用。

本发明进一步提供所述细胞系在筛选与pls3蛋白特异性结合的多肽、小分子化合物、核酸以及筛选对pls3高表达细胞系有效的药物中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明构建的真核表达质粒pires2-zsgreen1-his-pls3是一种非病毒的肿瘤细胞特异性的高效表达载体，为肿瘤靶向基因治疗和临床诊断提供强有力的技术支撑。以zsgreen1为报告基因能更加直观、快捷地检测真核细胞的转染效率。该载体能够表达plastin-3蛋白全长，使plastin-3蛋白的基础功能研究更加准确、可靠。通过在plastin-3c端表达his标签的融合蛋白，有利于在plastin-3蛋白的基础功能研究中，用his标签抗体替代价格昂贵的plastin-3抗体，节省实验经费；另外，该真核表达质粒可应用于真核plastin-3蛋白的提取：对转染该质粒后的hek-293t或cho-k1细胞，进行温和的细胞裂解，将裂解后的上清液过装有ni-nta的镍柱，分离并纯化plastin-3蛋白。可将纯化后的plastin-3蛋白用于plastin-3相互作用的蛋白筛选以及plastin-3特异性结合多肽的筛选等；还可以通过简单替换载体的方法，将his-pls3克隆至pet-30a等原核表达载体中，构建pet-30a-his-pls3原核表达质粒。将该原核表达质粒转化大肠杆菌等原核生物，通过细菌发酵，从发酵液中提取pls3蛋白，有助于大规模制备plastin-3蛋白。

附图说明

图1为本发明的真核表达载体pires2-zsgreen1-his-hplastin-3的质粒图谱。

图2为本发明实施例1中从mcf-7细胞系中提取的mrna逆转录扩增后的plastin-3cdna片段的电泳结果；其中，m:5000bpdnamarker；1:plastin-3cdna片段。

图3为本发明实施例1中挑出的单菌落以seqidno.4和5为引物进行菌落pcr，得到的电泳结果。其中，m:2000bpdnamarker；1:真核表达载体转化dh5α。结果表明在250bp左右有一条主带，与目的条带大小吻合。

图4为本发明实施例1中用ecori和bamhi双酶切构建的真核表达载体，得到的电泳结果。其中，m:5000bpdnamarker；1:质粒双酶切的样品。

图5为本发明实施例2中筛选出的带有荧光蛋白报告基因的质粒转染人乳腺癌mcf-7细胞系48h后，在荧光下激发绿色荧光。

图6为本发明实施例3中筛选出的带有his标签的质粒转染人肾上皮293t细胞系48h后，westernblot检测蛋白的表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中采用的实验材料、仪器：

主要试剂：mcf-7细胞系、hek-293t细胞系、t-24细胞系(上海中国科学院细胞库)；dmem(hyclone)；fbs(gibco)；pires2-zsgreen1(yrbio)；dl2000、限制性内切酶ecori和bamhi、t4连接酶、dna聚合酶均购自takara；大肠杆菌dh5α、dl5000、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒均购自天根生化有限公司；qiaquickpcrpurificationkit(mn)；琼脂糖(biowest)胰蛋白胨和酵母提取物购自oxide；nacl(阿拉丁)；氯霉素(coolaber)；gelred(biotium)；逆转录试剂盒(roche)；

主要仪器：细胞培养箱(thermofisher)；热循环仪(thermofisher)；微型台式漩涡振荡器(vortex)；37℃恒温培养箱(太仓市科教仪器厂)；37℃恒温振荡培养箱(太仓市科教仪器厂)；凝胶成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司)；冷冻离心机(eppendorf公司)；紫外分光光度计(malcom，e-spect)；生物超净台(北京东联哈尔仪器)；水平电泳仪(bio-rad)。

实施例1pires2-zsgreen1-his-hplastin-3真核表达质粒的构建

1、实验方法

(1)细胞的传代

mcf-7细胞系传代时用胰蛋白酶消化1-3min，加入等量含fbs的培养基，移至离心管中，1,000rpm离心5min。弃去消化液，加入1-2ml培养基，吹打均匀，取适量细胞至新的培养瓶中，再加入适量含10％fbs的培养基，于37℃和5％的co2培养箱中培养。

(2)trizol法提总rna

移除六孔板中的培养基，pbs洗一遍，每孔加1mltrizol，充分裂解细胞(剧烈晃动六孔板约1min)，转移至1.5ml离心管中(可过夜放于-20℃中)。分层，加0.2ml氯仿/管，剧烈摇晃15s，静置5min，4℃，12,000g离心15min。离心后，混合物分层。下层为红色苯酚-氯仿相，上层为无色水相，rna即溶于水相中。水相体积大约占最初所用trizol试剂体积的60％。转移上层无红色的水相至另一个离心管中，约400μl(可吸500μl)，用200μl的移液器吸上层液体，切勿将中间的一层吸入。剩余的有机相可用来提取蛋白质或dna。向上层液体中加入0.6ml异丙醇/管(确保异丙醇与rna溶液体积比不小于1∶1)，颠倒混匀，静置10min。于4℃，10,000g离心10min。离心前可能看不到rna沉淀，离心后rna呈胶状沉淀于管壁或管底。为了加快rna的溶解，尽量用枪头将上清吸尽。

(3)rna的纯化

短时间干燥rna沉淀，可用空气干燥或真空干燥10min，但不能真空离心干燥，因为完全干燥沉淀会降低rna的溶解度。提取的rna用mn公司的nucleospinrnaclean-up试剂盒进行纯化。向沉淀rna中加100μl无rnase水，可在55-60℃放10min增加溶解度。等量混合ra1与无水乙醇(300μl+300μl/管)。以6管样品为例，取3个1.5mlep管，每管加入700μlra1+700μl无水乙醇，混匀。待rna完全溶解后，向每管rna溶液中加入0.6ml混合物，颠倒混匀(总体积为0.7ml)。将混合物转移到柱子上，静置1min，10,000rpm离心1min。将柱子转移至2mlep管中，加ra30.7ml，10,000rpm离心1min。弃管内液，柱中加入350μlra3，10,000rpm离心1min。再弃管内液，10,000rpm离心2min，甩干。柱子转移到新管，打开放置2-3min，使乙醇挥发干净。65℃预热无rnase水。将每管中加入30μl预热水，放置1min，10,000rpm离心1min。重复上述步骤，增加回收率。取2μlrna溶液，稀释50倍，于紫外分光光度计测浓度，其余-80℃冻存。溶解的rna样品的a260/280应该在1.6-1.8之间。

(4)rna逆转录为cdna

逆转录试剂盒购自roche，逆转录步骤如下:

1)按照检测的浓度，取1μg总rna至无rnase的0.2mlep管中，加入1μlanchored-oligo(dt)18，h2o11μl，使总体积达到13μl。

2)将ep管放至热循环仪中，65℃变性失活10min。

3)取出ep管，冰上放置，配制下述混合液：

每管加7μl上述混合液，使最终反应体系为20μl，混匀。

4)放入热循环仪中，设置42℃，5min；55℃，55min；70℃，15min。可保存在-80℃中。如进行聚合酶链式反应实验，可在最终体系中加100μl灭菌水，进行后续实验。

(5)聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)

反应体系如下：

pcr程序设置如下：

(6)琼脂糖凝胶电泳

用0.5×tbe电泳缓冲液配制1％的(g/ml)琼脂糖凝胶溶液，于微波炉中加热至胶溶化充分后按照1∶10,000的比例，加入gelred(美国biotium公司)。待胶稍冷后倒入放好梳子的凝胶槽中凝固，将凝胶槽放入含电泳缓冲液的电泳槽中，将dnaladder加在一侧，用10×loadingbuffer将dna片段或质粒小心加入凝胶孔中，不要溢出来。连接好电泳仪后，调电压至80v，电泳约30min。在紫外灯下观察电泳条带，根据片段大小判断扩增产物是否为所要片段。在凝胶成像仪上将所得结果拍照，保存记录。

(7)pcr产物的纯化

使用试剂盒qiaquickpcrpurificationkit，用于纯化从pcr或其他酶反应得到的单、双链dna片段。按pbbuffer与pcr样品5：1的比例加入pbbuffer(例25μl+125μlbuffer)，混匀。将qiaquick吸附柱

放入2ml收集管中。样品加入吸附柱中，12,000g离心1min(该步骤用于结合dna)。弃掉滤过的液体，加入0.75mlpebuffer至柱中，离心1min。弃掉滤过液，再离心1min，开盖室温放置10min至吸附膜变干。将qiaquick柱放至新的1.5ml离心管中，加入30μl水至qiaquick膜上，放置1min，12,000g离心1min(浓缩dna片段，为了在酶连过程中保证最大的连接效率)。可于-20℃保存。

(8)双酶切反应

配制两个反应体系：

37℃酶切3h。

(9)酶切产物的回收

根据dnaladder指示的分子量切胶回收，取前沿最亮条带进行切割。向吸附柱中加入500μl平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉废液。向胶块中加入3倍体积的溶胶液pn。若胶块体积<0.1μg，视体积为100μl。50℃水浴放置10min，其间温和地上下翻转离心管。待稍微冷却后，加入吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉滤液。再向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心1min，倒掉滤液。重复加入漂洗液，离心。吸附柱放回收集管后，12,000rpm离心2min，尽量除尽pw。将吸附柱置于室温晾8-10min，挥发乙醇，防止影响后续酶反应。向吸附柱中加入30μl灭菌水，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将dna溶液收集到新的离心管中。

(10)酶连接反应

连接反应体系如下：

dna片段的摩尔数应控制在载体dna摩尔数的3-10倍范围内。常温下连接5-6h。

(11)转化

将酶连产物加入50μldh5α菌液中，轻轻旋转混匀。所用dna体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。冰浴中放置30min。在42℃热休克45s，迅速转移到冰浴中。冰浴静置2min，该过程不要摇动离心管。加入不含氨苄的lb培养基500μl，在37℃恒温培养箱中于150rpm/min振摇1h，目的是使菌体复苏，使质粒上相关抗性标记基因表达。取100-200μl培养液加到含氯霉素(100μg/ml)的lb琼脂平板上，用无菌的三角涂布棒轻轻地将细胞均匀涂开。将平板置于室温，直到液体被吸收，晾干平板。在37℃倒置培养10-16h，观察是否长出抗性菌落；时间不能过长，否则会出现卫星菌落。

(12)菌落pcr

采用牙签法挑菌落。在含氨苄的lb琼脂平板反面用marker笔划出16个正方小格，作为备用。pcr反应体系总体积为10μl，pcr小管中提前加入5.5μl灭菌水，用高温高压灭菌的牙签轻挑平板上的单克隆菌落，在一个正方小格的固体培养基上轻划斜线，而后在pcr小管中轻转牙签尖头，即完成一个菌落的挑选工作。在pcr小管中再加入0.5μlprimer和5μlprimerstarhs，序列见seqidno.4和5。

将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳条带，根据片段大小判断该菌落是否为目的菌落。用牙签在阳性pcr对应的菌落小格表面轻轻挑菌，加到适量的含氯霉素的液体培养基中做质粒提取准备。

pcr程序如下：

(13)小量质粒的提取

提质粒时可从冻存的菌液中沾取少量菌液在无氯霉素的平板上划线，倒置培养，活化冻存菌液。待长出单菌落，从平板上挑取单菌落，或者从冻存的菌液中吸取100μl直接接入无氨苄的含5mllb培养基的试管中，37℃，250rpm振摇过夜。12-16h后，od600值为0.3-0.4左右，提取质粒。

柱平衡步骤：向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，5,000rpm离心1min，尽量吸除上清(通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1(提前加入rnasea)，使用涡旋振荡器或移液器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。注意加入p3后应立即混合，避免产生局部沉淀。将上清液用移液器转移到吸附柱中，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心1min，倒掉废液，重复漂洗一次。将吸附柱放入收集管中,12,000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。将吸附柱开盖，置于室温数分钟，或者60℃金属浴挥干乙醇，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl无菌水，室温静置1min，12,000rpm离心2min。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加回吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。用紫外分光光度计检测稀释后质粒的浓度及纯度，纯度＝od260/od280(1.6-1.8)；浓度＝od260×50×稀释倍数1od260≈50ng/ml。提取的质粒命名为pires2-zsgreen1-his-hplastin-3(图1)。

(14)酶切验证

配制双酶切体系如下：

进行琼脂糖电泳，根据dnaladder的条带指示，判断酶切产物的条带是否与与目的条带吻合。

(15)碱裂解法大提质粒

将菌液接种到10ml含氨苄的液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养过夜。用50ml离心管，4,500rpm离心10min/次，常温收菌。每50ml菌液加2ml溶液i(50mm葡萄糖，25mmtris-cl，10mmedta，ph8.0；高压灭菌后于4℃贮存)，用振荡器剧烈振荡，完全悬浮菌液。每50ml菌液加新鲜配制的3ml溶液ⅱ(0.2nnaoh/1％sds(新鲜配制)，轻轻颠倒混匀。应确保离心管的整个内壁均与碱裂解液ⅱ接触。每50ml菌液加3ml用冰预冷的溶液iii(kac29.4g，冰乙酸11.5ml，加蒸馏水至100ml，4℃保存)，轻轻颠倒混匀，至溶液完全澄清后，室温放置10min。12,000rpm4℃离心15min，收集上清液，按0.6倍体积加入异丙醇，充分混匀，室温静置20min以上，12,000rpm，4℃离心15min。弃去上清，滤纸上扣干。室温，用2-3ml75％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm，4℃离心10min。除尽乙醇，60℃烘干，用3mlte(ph8.0)溶解沉淀。质粒的纯化。加入与te等量的预冷的3mol/llicl，4℃沉淀30min，10,000rpm，4℃离心10min。将上清转移至另一10ml离心管中，加入等量异丙醇，充分混匀，室温下10,000rpm离心10min。弃去上清，滤纸上扣干。75％乙醇洗涤沉淀，1ml/管，烘干。加入500μl溶解核酸沉淀，静置20min。加入rnasea(20mg/ml)按1∶100稀释，37℃消化3h(或室温过夜)。加入等体积(500μl)tris-饱和酚剧烈震荡，静置10min，10,000rpm离心10min。取上清，加入等体积酚氯仿(250μl+250μl)，剧烈震荡，静置10min，12,000rpm离心10min。取上清，加入500μl氯仿，剧烈震荡，静置10min，12,000rpm离心10min。取上清，转移至另一离心管中，加入100μl(约为水相体积的1/5-1/10)2mol/lnaac，充分混匀，加入2.5倍体积(约1ml)无水乙醇，-20℃过夜(或-80℃4h)，12,000rpm4℃离心10min。弃上清，加200μl75％乙醇洗涤，12,000rpm4℃离心2min，60℃挥干乙醇。用过量的水，约100μl溶解沉淀(20min，60℃)，取少量溶液稀释后测定od值，-20℃保存。

2、实验结果与分析

plastin-3cdna的目的条带约在2000bp左右，取前沿最亮条带进行切割(图2)。切割后的胶进行胶回收。胶回收后的cdna片段与pires2-zsgreen1质粒进行ecori和bamhi双酶切。双酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，然后二者以一定比例进行酶连接。连接产物转化dh5α感受态，将菌液均匀涂抹含有氯霉素的平板，次日挑单克隆，进行菌落pcr实验。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳条带，该片段大小约为200bp，与目的条带吻合(图3)。接下来，采用双酶切的方法进行验证。根据dnaladder的条带指示，检测有两条主带，分别在5000bp和2000bp左右，与plastin3cdna的条带和pires2-zsgreen1质粒条带的片段吻合(图4)。酶切验证通过后，进行一代双向测序，检测结果表明与序列seqidno.1相一致。由此构建得到pires2-zsgreen1-his-hplastin-3真核表达质粒。

pires2-zsgreen1载体中含有ires元件，将多克隆位点隔开，可以构建同时表达两个基因的重组质粒。当采用该质粒转染真核细胞时，目的基因与报告基因zsgreen1共转录为一个mrna，但分别翻译，既能监测是否转染成功，又避免报告基因蛋白影响目的基因蛋白的结构和功能；zsgreen1是亮度最高的绿色荧光蛋白，适合流式细胞仪以及其他荧光筛选；pires2-zsgreen1质粒为高拷贝质粒，含有筛选基因neo基因，能够用于筛选表达plastin-3蛋白的稳定细胞系。因此本发明中采用pires2-zsgreen1载体来进行plastin3全长基因的构建，相比其他真核载体更具优势。

对转染该质粒后的hek-293t或cho-k1细胞，用celllysisbuffer进行温和的细胞裂解，将裂解后的上清液过装有ni-nta的镍柱，通过改变洗脱液中咪唑的浓度，分离并纯化plastin-3蛋白。

实施例2pires2-zsgreen1-his-hplastin-3转染mcf-7细胞系

为了检测实施例1中构建的真核表达载体pires2-zsgreen1-his-hplastin-3是否能够成功转染，本发明特采用在不需抗体、辅因子、酶底物等其他成分，且不影响宿主细胞的独特报告蛋白-绿色荧光蛋白zsgreen1的表达。采用荧光显微镜，在荧光激发情况下，根据细胞是否发绿色荧光即可分析该报告基因是否成功表达以及该质粒是否转入真核细胞。

1、实验材料

opti-mem和lipofectamine2000均购自thermofisher公司。

2、实验方法

以六孔板为例，细胞密度为50-70％适宜。在两个rnase-free的1.5mlep管a管和b管中分别将1μg质粒(空载和plastin-3质粒)和2.5μllipo2000加入100μlopti-mem无血清培养基中，室温静置5min。吸取b管中液体慢慢滴加至混有a管中，静置10-20min。转染期间，将六孔板中培养基换成无血清培养基，每孔0.8ml。静置结束后，将a管中的液体缓慢加入六孔板中。整个过程避免气泡。

3、实验结果与分析

转染48h后，在荧光显微镜下观察zsgreen1的表达情况(图5)。空载组和plastin3组都成功表达绿色荧光，表明质粒转染成功，且zsgreen1能够成功表达。

实施例3plastin-3在293t细胞系过表达

为了检测实施例1中构建的真核表达载体pires2-zsgreen1-his-hplastin-3是否能够成功表达his标签和plastin-3蛋白，本发明分别采用westernblot的方法检测二者的表达情况。

1、实验材料

主要试剂：

蛋白质预染marker：美国fermentas公司；抗体信息如下：plastin3(santacruz,ca,usa)；细胞裂解液和his-tag(cellsignalingtechnology)；β-actin(博奥易杰公司)；pvdf和ecl发光液购自millipore；bca蛋白浓度测定试剂盒(beyotime)；proteaseinhibitorcocktail(calbiochem)。

主要仪器：

凝胶成像仪和垂直电泳仪均购自bio-rad。

2、实验方法

(1)转染hek-293t细胞

转染方法如实施例2中方法所示，分别用空载和plastin-3转染hek-293t细胞系。转染细胞培养48h后，提取总蛋白。

(2)蛋白含量的测定

1)取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管标准蛋白(30mg,bsa)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即分装于-20℃长期保存。

2)取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50∶1)，配制适量bca工作液，充分混匀。bca工作液室温24小时内稳定。

3)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

4)各孔加入200μlbca工作液，37℃放置20-30分钟后测定。测定时，采用酶标仪，在570nm处测量各孔od值，绘制标准曲线，计算蛋白含量，根据实验需要分装蛋白样品，并保存在-80℃冰箱中备用。

(3)westernblot

用预冷的1×pbs冲洗细胞样品，加入适量的细胞裂解液，裂解液中按1∶100加入蛋白酶抑制剂。立即用细胞刮刀刮下细胞使其与裂解液充分混合，冰浴30min。裂解后，于4℃，12,000rpm离心15min，收集上清于新的ep管中。用bca试剂盒测定蛋白含量。将样品与5×上样缓冲液按1∶4混合，煮沸10min，离心取上清。总蛋白的上样量为15μg。用移液枪吸取处理好的样品，缓慢加至加样孔内。开始电泳，待样品完成浓缩步骤，由80v调至120v。

电泳结束后，转膜。剪取对应大小的pvdf膜，在甲醇中浸泡

1min，再置于蒸馏水中。凝胶要尽量放正，用玻璃棒去除气泡(小心操作，注意勿将凝胶弄碎)。根据蛋白marker判断上样的顺序，并将pvdf膜完全覆盖于凝胶上，剪去一角作为标记。转印膜上依次叠放浸润好的三层滤纸和一层海绵，合上转膜夹。整个过程应避免引入气泡。根据目的蛋白性质设定转膜电流及转膜时间，开始转膜，一般转膜时间为在200ma下转膜2h。

配制5％脱脂奶粉封闭，摇床孵育0.5h以上或孵育过夜。根据蛋白marker指示的分子量，裁剪pvdf膜。pvdf膜放入杂交袋中，加入用1％bsa稀释好的一抗溶液，4℃摇床过夜或常温下2h。次日用pbst冲洗3次，每次10min。之后加入用1％bsa稀释好的二抗溶液(稀释比例为1∶3000)，摇床孵育1h。pbst冲洗3次，每次10min。膜上滴加ecl发光液，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统凝胶成像仪捕获图像。

3、实验结果与分析

转染293t细胞48h后，提取蛋白，检测蛋白含量。根据蛋白浓度调整样品上样量，进行westernblot实验，分别用anti-his(购自cellsignalingtechonology，12698)和anti-plastin-3抗体(购自santacruzbiotechnology,sc-166208)进行检测。结果如图6所示，在内参β-actin表达量一致的情况下，与空载组相比，plastin-3组成功高表达his标签和plastin-3蛋白，表明质粒转染成功。表达的his标签蛋白条带在70kd左右，与plastin-3蛋白条带大小一致，表明融合蛋白his-plastin-3能够成功表达。

实施例4利用t-24/pls3稳定高表达细胞系筛选抗癌药物

为了筛选对pls3高表达细胞系有效的药物，本发明通过构建pls3稳定高表达的t-24/pls3细胞系，采用srb的方法检测不同抗膀胱癌药物对t-24/pls3细胞系的杀伤作用，从而筛选出对pls3高表达细胞系有效的抗癌药物。

1、实验材料

主要试剂：g418购自amersco公司。

主要仪器：多模式微孔板检测系统(enspire)

2、实验方法

(1)无限稀释法筛选单克隆稳定株细胞

按照细胞转染的方法，将携带目的基因的质粒或空载质粒转染目的细胞t-24细胞，转染48h之后，根据质粒的筛选标记，选择含500μg/mlg418的选择性培养基培养t-24细胞。根据细胞状态定期换液，2周后将存活细胞消化，计数，将200个稀释细胞转移至2个96孔板中，每孔100μl。继续置于细胞培养箱中培养，期间向96孔板添加一定的培养基。待单克隆细胞簇长满后，将细胞小心消化，转移至48孔板中，继续培养。同理，将长满的细胞依次转移至24孔板，12孔板以及6孔板后，扩大培养。收集细胞蛋白，通过westernblot实验鉴定plastin-3的高表达情况，筛选出符合要求的单克隆细胞，至少筛选出2株细胞，留作后续实验使用。将挑选出的单克隆稳定株细胞扩大培养，冻存细胞以便保种。

(2)srb法检测药物对t-24/pls3的增殖抑制作用

a)将转染空载和目的基因的t-24稳定细胞系，分别定义为对照组和pls3组，调节其传代时间至同一时间，同时进行消化，计数，以4×10³-5×10³/孔细胞的数量接种96孔板，100μl/孔。次日给药，加入不同浓度的顺铂等抗膀胱癌药物。给药48h后，将储存液浓度为50％(m/v)的三氯乙酸(tca)用pbs稀释至终浓度为10％。每孔加入100μl，4℃放置l小时，固定细胞。弃固定液，用蒸馏水洗涤至少5次，空气中自然干燥。

b)加入srb溶液，以96孔板中每孔加入50μl，室温下放置10-30min。去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气中干燥(可过夜)。加入ph为10.5的tris溶液，96孔板中每孔加入150μl，在平板振荡器上振荡5min。多模式微孔板检测系统测定od值，用空白对照调零，所用波长为570nm。重复上述实验至少2次。

c)按以下公式计算肿瘤细胞生长的抑制率：抑制率＝[(od570对照孔-od570给药孔)/od570对照孔]×100％。根据各浓度抑制率，采用logit法计算半数抑制浓度ic50。以上每个实验重复至少3次，用sigmaplot10.0软件求出3次实验的平均ic50值。各重复孔的od值取平均数±sd。

3、实验结果预期

以对照组ic50为对照，对比同一种抗癌药物对pls3细胞系的ic50，比较不同抗膀胱癌药物对plastin-3高表达细胞系的杀伤作用，从而筛选出对plastin-3高表达细胞系依然具有杀伤作用的抗癌药物。针对原位瘤plastin-3高表达的膀胱癌患者临床用药，具有一定的指导意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>国家纳米科学中心

<120>pls3重组蛋白真核表达质粒及其构建方法和应用

<130>khp171114295.1

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1893

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

atggatgagatggctaccactcagatttccaaagatgagcttgatgaactcaaagaggcc60

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<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>39

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<210>5

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<213>人工序列

<400>5

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