一种重组亚硝酸盐还原酶及其构建方法与流程

本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌lj01亚硝酸盐还原酶的基因克隆和分别16℃～37℃培养温度下尝试表达目的蛋白，利用sds-page来对比分析重组蛋白的表达情况，从而确定nir表达的最佳诱导温度为16℃震荡培养20～24h，且有利于后续放大试验及其相关研究。

背景技术：

硝酸盐和亚硝酸盐主要通过蔬菜食用进入人体，亚硝酸盐是一种有毒物质，人食用后会在体内产生致癌性的亚硝胺，可导致胃癌、肠癌和肝癌等，且大量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症(methemoglobin)，产生常见的亚硝酸盐急性中毒症状。因此严格控制食品中亚硝酸盐含量非常重要。当前研究的反硝化细菌大多为致病微生物和土壤微生物，例如geobacilluskaustophilus、bacillusmegaterium、geobacillusthermodenitrificans、alcaligenesxylosoxidans、ralstoniapickettii，它们能够合成一种亚硝酸盐还原酶(nitritereductase，nir)，其具有较强的降解亚硝酸盐的能力，但是这些细菌不能食用，无法应用在食品中。目前应用在食品中的反硝化细菌主要是乳杆菌，已报道的有干酪乳杆菌鼠李糖亚种lactobacilluscaseisubsp.rhamnosus6013、植物乳杆菌lactobacillusplantarum、短乳杆菌lactobacillusbrevis等。研究表明，大多数乳酸菌的亚硝酸盐还原酶酶活对于土壤中的反硝化细菌来说是比较低的。

笔者所在研究组在豆瓣酱中分离得到一株芽孢杆菌，命名为lj01，可应用于食品中，前期研究发现该菌株同样可以合成具有高酶活的nir，而目前食品来源的芽孢杆菌中nir的研究极少。本研究组在前期直接从bacilluscereuslj01天然菌中分离纯化nir，但是提取率不到3％。类似地，haloferaxdenitrificans中nir的提取率为0.9％(inatomik,hochsteinli.thepurificationandpropertiesofacoppernitritereductasefromhaloferaxdenitrificans[j].currentmicrobiology,1996,32(2):72-76)，vigara从1944mg的monoraphidiumbraunii中粗酶液中仅分离得到0.015％nir(vigaraj,garcia-sanchezmi,garbayoi,etal.purificationandcharacterizationofferredoxin-nitritereductasefromtheeukaryoticmicroalgamonoraphidiumbraunii[j].plantphysiology&biochemistry,2002,40(5):401-405)。

由于粗酶液中蛋白种类太多，而目的蛋白含量太低(提取率只有2.37％)，导致目前纯化工作十分困难。

技术实现要素：

为了研究蜡样芽孢杆菌bacilluscereuslj01中nir的性质，解决天然nir含量低且难于纯化的问题，本发明通过对其nir进行基因克隆和试表达来确定nir表达的最佳诱导温度，从而有利于后续放大试验及其相关研究。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种重组亚硝酸盐还原酶的构建方法，利用pcr技术扩增蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)中的亚硝酸盐还原酶基因后，克隆到载体上并转化表达宿主菌，加入iptg诱导后的重组菌在16℃～37℃震荡培养，然后将发酵液离心后取菌泥，重悬进行高压破碎提取粗酶液。具体步骤如下：

(1)以ncbi中bacilluscereus亚硝酸盐还原酶的编码基因为模板，进行上下游引物设计；

(2)提取b.cereuslj01的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；所述b.cereuslj01的保藏编号为cgmccno.9360；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增nir片段和质粒于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒加入到50～200μl克隆菌株的感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激45～90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育30～45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到50～200μl表达菌株的感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激45～90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育30～45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有适当抗生素的lb液体培养基中，37℃震荡培养12～16h得到种子液，将种子液按1％～2％接种量接种至含有适当抗生素的lb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.6～0.8，取少量菌液作为诱导前对照，记为对照组。对照组菌液于4～10℃、10000～14000rpm离心30～50min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后制样，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.6～0.8时，加入iptg诱导后，将菌液在16℃震荡培养20～24h，或在25℃震荡培养18～20h，或37℃震荡培养2～6h。

(7)将发酵液离心后弃上清，用无菌水重悬，以此清洗两次，收集得到菌泥；向菌泥中加入体积分数10％的缓冲液混匀，高压破碎菌体3～5次，压力为100～150mpa，水温4～6℃，高压破碎后，在4℃、8000～12000rpm离心30～50min，得到上清液和沉淀。所述发酵液离心的条件为8000～12000rpm离心5～10min。得到上清液和沉淀分别制样，进行sds-page分析。所述的sds-page用的5×loading染色剂含有体积比为1/2000的巯基乙醇。

所述蜡样芽孢杆菌b.cereuslj01菌株中nir的基因序列如seqidno.1所示，其编码的蛋白序列如seqidno.2所示。

所述的载体为pet32a或pet28a。

所述的表达宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)或rosetta2。

所述的克隆菌株为top10。

所述震荡培养的条件为：16℃培养20～24h，或者25℃培养18～20h，或37℃培养2～6h。

所述iptg的浓度为0.1～1mmol/l。

所述高压破碎提取粗酶液的具体步骤如下：

所述缓冲液的组成是20mmtris、500mmnacl、7mmol/l巯基乙醇，室温下调至ph7.5。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)通过克隆nir基因然后在宿主细胞中大量表达，同时通过质粒使得重组蛋白带有特定标签从而简化纯化过程。例如质粒pet28a和pet32a带有his标签，使重组菌表达的重组蛋白nir同样具有his标签，而his标签和咪唑竞争性结合ni-nta填料，从而能通过ni-nta亲和层析将重组蛋白nir分离出来。

(2)本发明利用克隆表达技术，将b.cereuslj01中nir基因片段克隆到特定载体上，转化到宿主菌，利用iptg进行诱导，在16℃温度下培养宿主菌20～24h，从而使nir的提取率达到50％以上。

蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01的保藏信息：蜡样芽孢杆菌lj01于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏号cgmccno.9360；该保藏证明已在中国专利cn104212739a中提交。

附图说明

图1是重组菌pet32a-nir-bl21在诱导温度为16℃时nir的试表达结果。

图2是重组菌pet32a-nir-bl21在诱导温度为25℃时nir的试表达结果。

图3是重组菌pet32a-nir-bl21在诱导温度为37℃时nir的试表达结果。

图4是重组菌pet28a-nir-rosetta2在诱导温度为16℃时nir的试表达结果。

图5是重组菌pet28a-nir-bl21在诱导温度为16℃时nir的试表达结果。

图6是重组菌pet21a-nir-bl21中nir的试表达结果。

图7是重组菌pet21a-nir-bl21star中nir的试表达结果。

图8是重组菌pet21a-nir-rosetta2中nir的试表达结果。

图9是重组菌pgex-4t-2-nir-bl21star中nir的试表达结果。

图10是重组菌pet32a-nir-bl21star中nir的试表达结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1重组菌pet32a-nir-bl21的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccaggatccgaaaacctgtattttcagggaatgagttatgaaaaag，下游引物为tggctcgagctaagacgctattacttc，酶切位点分别为banhi、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pet21a于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet32a-nir加入到50μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到50μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养12h得到种子液，将种子液按1％接种量接种至含有1mmol/l氨苄青霉素的500mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.6，取1ml菌液于4℃、13000rpm离心35min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.6时，加入0.2mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养23h，在25℃、220rpm培养20h，37℃、220rpm震荡培养5h。

(7)将发酵液于9000rpm离心9min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于9000rpm离心9min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体3次，压力为150mpa，水温4℃，高压破碎后，在4℃、9000rpm离心45min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

将高速离心后“s”样品经过孔径为0.22μm、直径为25mm的滤膜过滤后，与经过预处理的ni柱填料在4℃下孵育1h，转移到ni柱上，收集穿出液，记为“ft”；再用于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)平衡ni柱，并收集洗出液，记为“a”；洗至基线后，再依次用含25、50、75、250、500mm咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗出液，依次记为“25、50、75、250、500”，分别取样进行sds-page分析。

重组菌pet32a-nir-bl21中亚硝酸盐还原酶(nir)的试表达结果如图1、2、3所示，该重组菌经iptg诱导后，nir试表达效果最佳的培养温度依次为16℃、25℃、37℃。当诱导温度为16℃和25℃时，重组nir主要在50、75、250mm咪唑的磷酸盐缓冲液被洗脱下来，诱导温度为16℃时对应条带的杂带少，而诱导温度为25℃时在“75”和“250”条带明显有分子量约为25kda的杂带；当诱导温度为37℃时，重组nir主要在75、250mm咪唑的磷酸盐缓冲液被洗脱下来，但明显有很多杂带。

实施例2重组菌pet28a-nir-rosetta2的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccagctagcatgagttatgaaaaagtatg，下游引物为tggctcgagctaagacgctattacttc，酶切位点分别为ndei、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pet28a于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet28a-nir加入到50μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有1mmol/l卡那霉素和1mmol/l氯霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到50μl大肠杆菌rosetta2感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有1mmol/l卡那霉素和1mmol/l氯霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养12h得到种子液，将种子液按1％接种量接种至含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氯霉素的450mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.6，取1ml菌液于4℃、13000rpm离心35min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.6时，加入0.2mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养24h。

(7)将发酵液于9000rpm离心9min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于9000rpm离心9min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体3次，压力为150mpa，水温4℃，高压破碎后，在4℃、9000rpm离心45min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

将高速离心后“s”样品经过孔径为0.22μm、直径为25mm的滤膜过滤后，与经过预处理的ni柱填料在4℃下孵育1h，转移到ni柱上，收集穿出液，记为“ft”；再用于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)平衡ni柱，并收集洗出液，记为“a”；洗至基线后，再依次用含25、50、75、250、500mm咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗出液，依次记为“25、50、75、250、500”，分别取样进行sds-page分析。

重组菌pet28a-nir-rosetta2在诱导温度为16℃时nir的试表达结果如图4所示，该重组菌经iptg诱导后，在培养温度为16℃时，重组nir主要在25、50、75、250mm咪唑的磷酸盐缓冲液被洗脱下来，但在“25”、“250”条带有其他杂带。

实施例3重组菌pet28a-nir-bl21的构建及其亚硝酸盐还原酶的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccagctagcatgagttatgaaaaagtatg，下游引物为tggctcgagctaagacgctattacttc，酶切位点分别为ndei、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pet28a于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet28a-nir加入到50μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml卡那霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到50μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml卡那霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养12h得到种子液，将种子液按1％接种量接种至含有1mmol/l卡那霉素的500mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.6，取1ml菌液于4℃、13000rpm离心35min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.6时，加入0.2mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养22h。

(7)将发酵液于9000rpm离心9min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于9000rpm离心9min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体3次，压力为150mpa，水温4℃，高压破碎后，在4℃、9000rpm离心45min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

将高速离心后“s”样品经过孔径为0.22μm、直径为25mm的滤膜过滤后，与经过预处理的ni柱填料在4℃下孵育1h，转移到ni柱上，收集穿出液，记为“ft”；再用于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)平衡ni柱，并收集洗出液，记为“a”；洗至基线后，再依次用含25、50、75、250、500mm咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗出液，依次记为“25、50、75、250、500”，分别取样进行sds-page分析。

重组菌pet28a-nir-bl21在诱导温度为16℃时nir的试表达结果如图5所示，该重组菌经iptg诱导后，在培养温度为16℃时，pet32a-nir-bl21中的重组nir主要在25、50、75、250mm咪唑的磷酸盐缓冲液被洗脱下来，但在“25”、“250”条带有少量杂带；与pet28a-nir-rosetta2相比，pet28a-nir-bl21在诱导温度为16℃时重组nir表达量较大，达到80％。

对照实施例1重组菌pet21a-nir-bl21的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccagctagcatgagttatgaaaaagtatg，下游引物为tggctcgagagacgctattacttc，酶切位点分别为ndei、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pet21a于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet21a-nir加入到50μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激45s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育30min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒pet21a-nir，加入到50μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激45s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育30min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养12h得到种子液，将种子液按1％接种量接种至含有50μg/ml氨苄青霉素的450mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.6，取1ml菌液于4℃、10000rpm离心50min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.6时，加入0.1mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养22h，在25℃、220rpm培养18h，37℃、220rpm培养4h。

(7)将发酵液于8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于8000rpm离心10min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体3次，压力为150mpa，水温4℃，高压破碎后，在4℃、8000rpm离心50min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

重组菌pet21a-nir-bl21中亚硝酸盐还原酶(nir)的试表达结果如图6所示，nir的自身分子量约为60kdaa，加上载体pet21a中n端的his标签后，重组nir的分子量约为61kda。重组菌pet21a-nir-bl21经iptg诱导后，在分别16℃、25℃、37℃培养下，nir试表达效果最佳的温度为37℃，但是与上清比较，重组nir主要是以包涵体形式存在于沉淀中，包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体，不具有生物学活性。

对照实施例2重组菌pet21a-nir-bl21star的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccagctagcatgagttatgaaaaagtatg，下游引物为tggctcgagagacgctattacttc，酶切位点分别为ndei、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pet21a于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet21a-nir加入到200μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到200μl大肠杆菌bl21star感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育45min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养16h得到种子液，将种子液按2％接种量接种至含有50μg/ml氨苄青霉素的450mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.7，取1ml菌液于4℃、14000rpm离心30min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.7时，加入1mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养24h，在25℃、220rpm培养20h，37℃、220rpm培养6h。

(7)将发酵液于12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于12000rpm离心5min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体5次，压力为100mpa，水温5℃，高压破碎后，在4℃、12000rpm离心30min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

重组菌pet21a-nir-bl21star中亚硝酸盐还原酶(nir)的试表达结果如图7所示，重组nir的分子量约为61kda，该重组菌经iptg诱导后，nir试表达效果最佳的培养温度依次为37℃、25℃、16℃。与上清比较，重组nir主要是以包涵体形式存在于沉淀中。

对照实施例3重组菌pet21a-nir-rosetta2的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccagctagcatgagttatgaaaaagtatg，下游引物为tggctcgagagacgctattacttc，酶切位点分别为ndei、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pet21a于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet21a-nir加入到120μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激70s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育40min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml氯霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到120μlrosetta感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激70s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育40min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml氯霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml氯霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养14h得到种子液，将种子液按1.5％接种量接种至含有50μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml氯霉素的500mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.8，取1ml菌液于4℃、12000rpm离心40min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.8时，加入0.5mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养20h，在25℃、220rpm培养19h，37℃、220rpm培养2h。

(7)将发酵液于10000rpm离心8min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于10000rpm离心8min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体4次，压力为120mpa，水温6℃，高压破碎后，在4℃、10000rpm离心40min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

重组菌pet21a-nir-rosetta2中亚硝酸盐还原酶(nir)的试表达结果如图8所示，nir的分子量约为60kda，该重组菌经iptg诱导后，nir试表达效果最佳的培养温度依次为25℃、37℃、16℃。与上清比较，重组nir主要是以包涵体形式存在于沉淀中。

对照实施例4重组菌pgex-4t-2-nir-bl21star的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccaggatccatgagttatgaaaaag，下游引物为tggctcgagctaagacgctattacttc，酶切位点分别为banhi、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pgex-4t-2于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pgex-4t-2-nir加入到100μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激60s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育35min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到100μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激60s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育35min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养13h得到种子液，将种子液按2％接种量接种至含有1mmol/l氨苄青霉素的500mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.7，取1ml菌液于4℃、11000rpm离心45min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.7时，加入0.8mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养21h，在25℃、220rpm培养18h，37℃、220rpm培养3h。

(7)将发酵液于11000rpm离心6min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于11000rpm离心6min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体3次，压力为140mpa，水温5℃，高压破碎后，在4℃、11000rpm离心35min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

重组菌pgex-4t-2-nir-bl21star中亚硝酸盐还原酶(nir)的试表达结果如图9所示，nir的分子量约为60kda，加上pgex-4t-2中n端的26kda的gst标签后，重组蛋白约为86kda。该重组菌经iptg诱导后，nir试表达效果最佳的培养温度依次为37℃、16℃、25℃。在16℃、25℃培养下，重组nir在上清的表达量明显高于在沉淀，而在37℃培养下，重组nir在沉淀的表达量高于在上清。

对照实施例5重组菌pet32a-nir-bl21star的构建及其nir的试表达

(1)以ncbi中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，设计上游引物为ccaggatccgaaaacctgtattttcagggaatgagttatgaaaaag，下游引物为tggctcgagctaagacgctattacttc，酶切位点分别为banhi、xhoi；

(2)提取蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)lj01(保藏编号为cgmccno.9360)的dna，并以此为模板，通过pcr技术扩增b.cereuslj01亚硝酸盐还原酶的基因片段(nir)；

(3)利用上下游两种工具酶将扩增片段和质粒pgex-4t-2于37℃下分别切成两个片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用t4dna连接酶连接，将重组质粒pet32a-nir加入到100μltop10感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激60s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育35min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养。从平板上挑取单菌落于lb液体培养基适当培养一段时间后，取菌液送测序；

(4)提取测序正确的阳性工程菌中的重组质粒，加入到100μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激60s后，冰水浴孵育2min。加入200μl已灭菌的lb液体培养基，在37℃孵育35min充分复苏，取菌液均匀涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，倒置，于37℃过夜培养；

(5)从平板上挑取单菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养13h得到种子液，将种子液按2％接种量接种至含有1mmol/l氨苄青霉素的500mllb液体培养基中，在37℃剧烈摇晃培养直至od600达到0.7，取1ml菌液于4℃、11000rpm离心45min，取沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“bi”，作为对照组进行sds-page分析。

(6)当od600达到0.7时，加入0.8mmol/liptg诱导后，将菌液分别在16℃、220rpm培养21h，在25℃、220rpm培养18h，37℃、220rpm培养3h。

(7)将发酵液于11000rpm离心6min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于11000rpm离心6min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100ml培养液得到的菌泥中加入10ml于4℃预冷的缓冲液a(20mmtris、500mmnacl、ph7.5、7mmol/l巯基乙醇)混匀，高压破碎菌体3次，压力为140mpa，水温5℃，高压破碎后，在4℃、11000rpm离心35min，得到上清液和沉淀，取40μl上清加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“s”，取少量沉淀加入40μl蒸馏水混匀后，再加入10μlloading染料(含有体积比为1/2000的巯基乙醇)制样，记为“p”，分别进行sds-page分析。

重组菌pet32a-nir-bl21star中亚硝酸盐还原酶(nir)的试表达结果如图10所示，nir的分子量约为60kda，加上pet32a中n端thioredoxin标签和两个his标签共30kda，重组蛋白约为90kda。该重组菌经iptg诱导后，nir试表达效果最佳的培养温度依次为16℃、25℃、37℃。与上清的重组蛋白含量相比，nir主要是以包涵体的形式存在于沉淀中。

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<110>华南理工大学

<120>一种重组亚硝酸盐还原酶及其构建方法

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