内置扰流装置的高效细胞培养瓶的制作方法

本发明属于生物技术领域，更具体地说涉及一种内置扰流装置的高效细胞培养瓶。

背景技术：

细胞培养瓶可在有限的人力、物力、空间的条件下，获得大量的实验数据。此外，摇瓶实验结果提供了细胞基本的生长信息和培养工艺参数，为大规模细胞培养提供技术参考。因此，细胞培养瓶被广泛应用于实验室研究和工业化生产。然而传统的细胞培养瓶仍存在以下问题：

(1)细胞的生长、发育、分裂、繁殖等生命活动均需消耗大量的氧气，参与三羧酸循环过程。传统的培养瓶瓶颈小且瓶底深且大，严重阻挡了气体的流通。培养瓶在摇床上沿培养瓶中心轴线作旋转运动，流体形态呈层流状态，不利于混合和氧传递。目前，研究者们常采用降低装液系数、提高转速的方法提高氧传质系数。然而，若装液系数过低，随着培养过程的进行，培养瓶内的水分大量蒸发，导致培养基的渗透压升高，抑制细胞生长。较高的摇床转速产生高剪切力，引起细胞破损或溶解死亡；此外，长时间极限转速运转会大大缩短摇床的寿命。

(2)为了解细胞的生长代谢状态，需不定时取样测定细胞生长参数，观察细胞形态。传统的培养瓶取样是在超净工作台通过无菌操作技术完成的。整个过程需耗费大量的时间、人力和物力。此外，取样过程需打开瓶帽和通气包装纸，并且需引入枪头、移液管等取样装置，增加了染菌风险。

(3)为维持细胞高生长速率和高细胞活力，需补充大量的营养物质。传统的培养瓶无补料添加装置，营养供给不足导致后期细胞生长缓慢，甚至趋向于裂解死亡，最终影响细胞密度和产物表达量。

(4)传统的培养瓶内壁焊接挡板或瓶体自身凹凸形成挡板，这无疑加大了培养瓶制造工艺的难度。传统的培养瓶加工的难点在于不能精准的设计挡板的尺寸、位置和形状，且瓶内焊接挡板构件工艺复杂。此外，培养瓶内设固定挡板，无疑也增加了清洗的困难，特别是细胞培养分泌产生的粘性物质难以清洗。

因此，有必要在满足细胞生长需求，特别是在满足溶氧需求的前提下，设计一种可快速取样、补料、转移的高效细胞培养瓶。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种内置扰流装置的高效细胞培养瓶，以克服现有技术的不足。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明实施例提供了一种内置扰流装置的高效细胞培养瓶，包括：

培养瓶本体；

与所述培养瓶本体密封连接的瓶帽，所述瓶帽上设置有至少一通气孔、至少一取样口、至少一补料口以及至少一转移口；

设置于所述培养瓶本体内的扰流装置，其由所述培养瓶本体的中心线向所述培养瓶侧壁的方向逐渐降低，且所述扰流装置在所述高效细胞培养瓶直立于水平面上时与所述水平面形成5～45°的倾斜角。

作为较佳优选实施方案之一，所述扰流装置包括复数个挡板机构，所述挡板机构通过连杆与下固定环固定连接，且该复数个挡板机构彼此间隔设置，所述下固定环通过肋筋与上固定环连接，所述上固定环、下固定环分别与所述培养瓶本体的侧壁、底壁胀紧适配。

进一步的，所述的复数个挡板机构于培养瓶本体的底壁上分隔形成复数个第一凹处和一第二凹处，所述第一凹处沿径向自培养瓶本体中心线向侧壁方向延伸，所述第二凹处环绕培养瓶本体中心线设置，所述第一凹处与第二凹处连通。

更进一步的，所述挡板机构包括前导面、拖尾面、上部面和底部面，所述上部面与所述前导面相接形成前导边，所述上部面与所述拖尾面相接形成拖尾边，所述上部面和底部面相接形成上部边，所述前导面和拖尾面相接形成倾斜边，所述前导边和拖尾边分别与所述水平面形成大小一致且方向相反的第一倾斜角和第二倾斜角。

更进一步的，所述第一倾斜角、第二倾斜角为30～60°。

更进一步的，所述上部面与水平面之间形成的夹角为5～45°，且所述倾斜边与水平面之间形成的夹角为10～175°。

更进一步的，所述第一凹处的横截面为梯形，与一第一凹处相邻的两个挡板机构中，一个挡板机构的拖尾边和另一个挡板机构的前导边分别构成所述梯形的侧边，并且所述的一个挡板机构的拖尾边的端点与所述的另一个挡板机构的前导边的端点连接从而形成所述的梯形横截面的上底和下底。

作为较佳优选实施方案之一，所述培养瓶本体包括依次连接的瓶颈、瓶主体以及瓶底，所述瓶颈的上端形成瓶口，所述瓶颈邻近所述瓶开口处设置有外螺纹，所述瓶帽内设置有与所外螺纹相匹配的内螺纹。

优选的，所述培养瓶本体底壁与侧壁通过平滑过渡的圆拐角或弧面连接。

优选的，所述培养瓶本体底壁的高度略高于所述圆拐角或弧面。

优选的，所述培养瓶本体侧壁下部与培养瓶本体中心轴线平行，侧壁中部倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，更优选的为5～45°，侧壁上部也倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，更优选为5～45°。

优选的，所述培养瓶本体为锥形瓶。

作为较佳优选实施方案之一，所述培养瓶本体的瓶口的直径接近于所述瓶颈的长度。

作为较佳优选实施方案之一，所述瓶帽内侧设有环形密封圈，所述环形密封圈位于所述培养瓶本体的瓶口边缘处和瓶盖之间，以提供液体密封。

作为较佳优选实施方案之一，所述的补料口或转移口与电磁阀或蠕动泵连接，所述电磁阀或蠕动泵与控制装置电连接。

作为较佳优选实施方案之一，所述的培养瓶本体的侧壁标有刻度线。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于:

(1)可原位取样，取样简单、快速，改变了传统取样需在超净工作内无菌操作完成。

(2)氧传质效率高，本发明提供的高效细胞培养瓶中内置扰流装置，且具有大敞开瓶口和通气性瓶帽设计，可以提供良好的通气和混合效果。

(3)转移效率高，与传统转接工艺相比，本发明提供的高效细胞培养瓶的瓶帽具有转移口，节省了液体转移至生物反应器的时间，转移时间仅为几分钟，降低了溢出的几率，且可单人操作。

(4)本发明提供的高效细胞培养瓶装液系数高，最高可高达60％。

(5)优异的放大性能，可轻松地从小尺寸(125ml)高效细胞培养瓶放大至大尺寸(5l)高效细胞培养瓶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明结构特征和技术要点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

图1为本发明实施例提供的高效细胞培养瓶本体的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的高效细胞培养瓶本体的俯视图；

图3为本发明实施例提供的扰流装置的结构示意图；

图4为本发明实施例提供的瓶帽的结构示意图；

图5为本发明实施例提供的高效细胞培养瓶的取样示意图；

图6为本发明实施例提供的高效细胞培养瓶的补料示意图；

图7为本发明实施例提供的高效细胞培养瓶的培养液转移示意图(重力转移法)；

图8为本发明实施例提供的高效细胞培养瓶的培养液转移示意图(蠕动泵转移法)；

图9为本发明实施例提供的250ml高效细胞培养瓶与5l高效细胞培养瓶内的细胞数、细胞活性比较示意图。

附图标记说明：1-瓶口，2-瓶颈边缘，3-瓶颈，4-侧壁，5-侧壁，6-侧壁，7-扰流装置，7a-前导边，7b-拖尾边，7c-上部边，7d-倾斜边，8-外螺纹结构，9-侧壁与底部拐角处，10-瓶底，11-第一凹处，12-第二凹处，13-上固定环，14-肋筋，15-连接杆，16-下固定环，17-通气孔，18-取样口，19-瓶帽外侧，20-瓶帽内侧，21-补料口，22-转移口，23-注射器，24-取样口密封，25-瓶内取样管，26-补料泵，27-250ml补料瓶瓶外补料管，28-250ml补料瓶瓶内补料管，29-250ml补料瓶，30-个人计算机，31-5l培养瓶瓶内补料管，32-5l高效细胞培养瓶，33-250ml培养瓶瓶外转移管，34-250ml高效细胞培养瓶，35-250ml培养瓶瓶内转移管，36-培养液转移泵，37-5l高效细胞培养瓶。

具体实施方式

以下将结合本实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行具体、清楚、完整地描述。

如图1～4所示，本实施例提供的高效细胞培养瓶包括密封连接的培养瓶本体和瓶盖，瓶帽内侧20有内部螺纹线，与培养瓶瓶颈处的外螺纹结构8配合，瓶帽外侧19为平面环形，瓶帽的顶部具有一个通气孔17、一个或多个端口(取样口18、补料口21、转移口22中任意的一种或几种)。

在瓶帽内侧20，沿着环形瓶帽外侧19处设有一环形密封圈。优选的，环形密封圈的外部边缘邻接瓶帽外侧19的内部，环形密封圈的内部边缘邻接环形法兰(瓶盖下)，环形法兰和瓶帽外侧19与环形密封圈形成咬合连接。优选的，环形密封圈由弹性密封材料构成，如天然橡胶、丁钠橡胶(人造合成橡胶)。当瓶盖与瓶颈卡接时，密封圈位于瓶颈边缘2处和瓶盖之间，形成液体密封。优选的，为避免瓶盖与瓶颈之间的螺纹连接过于紧或打滑，瓶帽外侧19应足够长，当瓶颈边缘2邻接环形密封圈时，瓶颈主体3末端邻接截止法兰。

优选的，密封圈包括o型密封圈或d型密封圈。可供选择的是，密封通过粘结或凹槽的方式连接，密封圈的大小与凹槽的大小吻合。密封最好可以是单层密封，也可以是双层密封或多层密封，各层密封之间最好以一定距离间隔。

所述的补料端21口或转移端口22与电磁阀或蠕动泵26、蠕动泵36连接，计算机控制电磁阀或蠕动泵26、蠕动泵36的开关或运转，以阻断或关闭料液进入培养瓶。补料的时间和补料量可通过计算机30人工设定。优选的是，通气孔17应当采用适当尺寸(通气孔最适直径为1.6mm)，即要满足液体能够从培养液转移口22和取样口18连续流出，避免气体堵塞，也要避免瓶内液体从通气孔溅出以及降低染菌风险。

在实际使用时，生长培养基通过瓶颈的敞开口，注入至培养瓶中，大的敞开瓶口使得操作更简易，通气孔允许气体自由进入培养瓶，确保液体连续流动。

可选择的是，位于盖子上的提示线可以提示使用者如何旋开瓶盖。当培养瓶内的液体低于瓶盖30与培养瓶的邻接处时，确保液体低于刻度线以及通气孔17保持打开。

所述的培养瓶本体又进一步包括瓶底10、瓶主体(瓶主体包括侧壁4，5，6)、瓶颈2、瓶口1和内置的扰流装置构件7。2.5l培养瓶底部直径为50mm，高为28cm，瓶颈长75mm，直径为75mm。优选的是，培养瓶由玻璃、聚合物材料构成，如聚丙烯。优选的是，培养瓶本体可以选用注塑成型或吹塑成型的方式，且可抛弃，减少循环使用带来的污染。

所述的培养瓶本体呈圆锥形、圆柱形、球形、正方体形、长方体形，但不限于此，还可以是其他形状。优选的，培养瓶本体呈圆锥形，培养瓶本体的底壁10与侧壁6之间以及侧壁4、5、6之间通过平滑过渡的圆拐角或弧面连接，瓶体底壁10略凸起，当培养瓶装液量比较低时，培养瓶内的流体可沿着瓶体底壁10的拐角处流动。瓶体的侧壁6与培养瓶中心轴线平行；侧壁5倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，优选的，倾斜角度为5～45°；侧壁4也倾斜于中心轴线，倾斜角度为1～80°，优选的，倾斜角度为5～45°。培养瓶本体的侧壁处也可设置液位线，并标有对应的培养瓶容积。

所述的瓶颈2位于瓶体侧壁4的末端，呈圆柱形、方形，但也不限于其它形状，优选的是圆柱形。瓶颈3边缘处设置有外螺纹结构8。外螺纹结构8可以为单条线、多条线，也可以为连续线或中断线，优选的是多条中断线。螺纹的形式不限于插销、法兰连接以及其它连接方式。法兰位于螺纹以下的位置，并延伸至瓶颈外，瓶颈2足够小以便于单手操作。瓶颈2的直径和其长度可改变，标记可打印至拐角9或培养瓶侧壁4、5、6。

如图1，在更优选的实例中，培养瓶包括瓶底10，培养瓶内置数个扰流装置7。优选的，培养瓶的底壁10与培养瓶侧壁4、5、6通过圆拐角的方式连接；但可供选择的，培养瓶侧壁4、5、6呈锥形，以一个或多个倾斜度接近中心轴线。培养瓶侧壁4、5、6连接瓶颈2。瓶颈2边缘处有一敞开瓶口1。侧壁6与中心轴线平行，侧壁5缓慢倾斜于中心轴线，侧壁5急速倾斜于中心轴线。随着扰流装置7的结构和尺寸的改变，培养瓶容器的外壁尺寸也随之改变。

扰流装置7可采用具有自动复位功能的弹性材质(如硅胶或橡胶)，也可采用无弹性的不锈钢材质或硬性塑料材质(如聚碳酸酯、聚酯、含氟聚合物、丙烯酸、pet、聚氯乙烯、abs、pc、ps、gag、亚克力和聚烯烃中的任意一种或两种以上的组合)。上述材质应当耐受不低于第二凹处121℃的高温灭菌处理、γ射线灭菌、β射线灭菌、化学试剂消毒灭菌处理。

扰流装置包括上固定环13、下固定环16、肋筋14、挡板、连接杆15，上下固定环13，16通过肋筋14连接成一体，上固定环13和下固定环16分别与培养瓶的侧壁4、5、6和底壁10适配，挡板通过连接杆15与下固定环16连接，并位于下固定环16的封闭的圆形空间内。

扰流装置7起到通气混合的作用，但不会破损细胞。扰流装置7的设计应降低剪切力，增强混合效果。因此，在使用培养瓶时，转速设定为特定值，内置扰流装置，可获得较佳的混合状态，较小的剪切力，避免细胞壁的破损。

在具体实例中，内置扰流装置7将饼型的瓶体底壁10分割成第一凹处11，第二凹处12，第一凹处11，第二凹处12由中心线向外延伸。挡板的形状为矩形、平行四边形、正方形、梯形、三角形中的一种或几种，优选的是矩形。挡板的数目可改变，优选的是偶数个。如图2-3所示的六个扰流装置7将培养瓶底部分割成六个凹处，相邻的两个第一凹处11之间的夹角为60°。当然，采用四个扰流装置7也是可行的，四个流装置7可以将培养瓶底部分割成四个第一凹处11，相邻的两个第一凹处11之间的夹角为90°。

培养瓶沿着某一方向连续旋转，优选的是顺时针方向，扰流装置7的各挡板沿着同样方向旋转。在实际运行过程中，配有相应的设备，由操作者控制旋转的方向。每个扰流装置7的挡板由前导面、拖尾面、上部面和底面组成，其中任意两个面之间均相互连接，所述上部面与所述前导面相接形成前导边7a，所述上部面与所述拖尾面相接形成拖尾边7b，前导边7a和一个拖尾边7b分别与水平面之间的倾斜夹角为30～60°(培养瓶的底壁10位于水平面上)，更优的，倾斜夹角为30～40°。培养瓶的旋转速度为20～300rpm，优选的，旋转速度为80～200rpm。当然，也可采用更高的旋转速度，但需调整夹角角度，以避免剪切造成细胞破损。因此，扰流装置10的设计需考虑旋转速度，以维持低剪切力，以避免细胞破损。

前导边7a和拖尾边7b延伸至中心线，呈放射状分布。中间部分7c通常为平面，但也可略微凸起。优选的是，扰流装置7将饼型的瓶体底壁10分割成第一凹处11、第二凹处12，但形状可改变。当培养瓶容器以一定速度旋转，挡板前导边7a和拖尾边7b与水平面的倾斜夹角可避免细胞破损。细胞感染后，收集细胞。搅拌轻微地影响通气，因为气泡的形成影响细胞壁的破损。如果搅拌转速增加，为了降低剪切力，夹角可能减小。

扰流装置7的各个挡板之间的间隔也影响流体的通气和搅拌。第一凹处11的横截面为梯形，与一第一凹处11相邻的两个挡板中，一个挡板的拖尾边7b和与另一个挡板的前导边7a分别构成所述的梯形横截面的侧边，一个挡板的拖尾边的端点与另一个挡板的前导边的端点连接从而形成所述的梯形上底和下底，且下底自然位于瓶体的底壁10处。优选的，前导边7a和拖尾边7b以同样程度倾斜，但方向相反，以利于流体轻轻地流经前导边7a，绕过上部边7c，经拖尾边7b流出。流体绕过第一凹处11，到达下一个前导边7a，流经下一个上部边7c，经下一个拖尾边7b流出至下一个第一凹处11，以此循环，从而引起的波浪起伏的流体流动，利于充气，且不会破损细胞壁。

培养瓶绕中心线旋转，中心线的流体速度最低。随着离中心轴线的距离增加，流体速度线性增加。流体和培养瓶容器之间的摩擦力可避免流体以某一速度旋转。拐角9(放射状最远处)处的流体流动速度大于中心线处的流体流动速度。

邻近拐角9处，扰流装置7处的流动速度最低；邻近中心线处，扰流装置7处的流动速度最高。优选的，邻近拐角9处的扰流装置顺利地融入底壁10和拐角9。优选的是，扰流装置7与拐角9之间的距离d是中心线至拐角外周线距离的1/3。在具体实例中，扰流装置与拐角之间的距离d约25mm。

培养瓶以80～180rpm旋转速度旋转时，扰流装置的上部面倾斜于水平面5～12°，在具体实例中，优选的倾斜角度为9°，优选的旋转速度为80～100rpm。

邻近中心线处，扰流装置7的流动速度最高。扰流装置7与中心轴线之间的距离是容器直径的1/8。扰流装置7向远离中心线的方向倾斜，并与水平面形成约为20～50°的夹角，优选的，夹角为38°。优选的，因直角方式连接剪切力大，因而避免倾斜边7d、上部边7c、前导边7a、拖尾边7b之间以直角方式连接进而以避免细胞损伤，在设计时一般以圆拐角的方式连接。

在一个具体实例中，扰流装置7包括六个挡板，各挡板之间的间距约5～8mm。在培养瓶半径2/3，邻近拐角处9，上部边7c与瓶体底壁10融合。六个饼形扰流装置7分割成六个矩形第一凹处11，并在中心线处形成一个第二凹处12。

在使用时，培养瓶装有1/3体积的生长培养基，完全浸没扰流装置7。优选的是，沿着中心线测量，扰流装置7与水平面底部的高度约为流体高度的1/3。更优的是，扰流装置的高度约为流体高度的1/5～1/10。

培养瓶固定在摇床上。侧壁4、侧壁45与夹具的中心轴一致，以80～180rpm速度旋转。流体波浪式流经扰流装置7起到搅拌、混合、充气的作用，避免细胞壁破损。

如图5所示，内置扰流装置7的高效细胞培养瓶34、32的取样方法如下：

1)旋开取样端口18处的取样口密封24；

2)连接注射器23和取样端口18后取样，其中瓶内取样管25与取样端口18连通；

3)旋紧取样端口18处的取样口密封24。

如图6所示，内置扰流装置7的高效细胞培养瓶32的补料方法如下(高效细胞培养瓶34相同)：

1)将高效细胞培养瓶32内的5l培养瓶瓶内补料管31与250ml补料瓶29的补料硅胶管27无菌焊接；

2)将补料硅胶管27安装在补料泵26泵头内，并且补料硅胶管27与250ml补料瓶瓶内补料管28连通；

3)调整补料泵26的转速和时间或电磁阀的开闭时间，并打开补料阀门，根据细胞生长状况开始补料。

内置扰流装置7的高效细胞培养瓶34内的培养液转移至另一的高效细胞培养瓶37的方法包括以下方法：

a)重力转移法(如图7所示)

a1)将细胞培养瓶34内的250ml培养瓶瓶内转移管与转移硅胶管33连接，并使得转移硅胶管33与高效细胞培养瓶37无菌焊接；

a2)细胞培养瓶34倒置或调整至适宜的位置；

a3)打开液体转移阀门，将培养液完全转入至高效细胞培养瓶37内。

b)蠕动泵转移法(如图8所示)

b1)将细胞培养瓶34内的250ml培养瓶瓶内转移管与转移硅胶管33连接，并使得转移硅胶管33与高效细胞培养瓶37无菌焊接；

b2)将转移硅胶管33安装在培养液转移泵36的泵头内；

b3)设置培养液转移泵36的转速和时间，并打开液体转移阀门，将培养液完全转入至高效细胞培养瓶37内。

以下结合具体的实施例及附图对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

为评价高效细胞培养瓶的高效的培养性能、装液系数、可操作性(染菌率、单次取样耗时、单次接种转移耗时)，对pk-15细胞和cho细胞进行培养，每种细胞各培养50瓶，培养条件如下：

pk-15细胞的培养条件：(1)高效细胞培养瓶：从250ml高效细胞培养瓶34接种至5l高效细胞培养瓶32，接种密度为0.6×10⁶cells/ml，2g/l载体介质(ge公司生产的cytodex-1)，37℃，5％co2培养。每隔1d利用补料泵26流加补加补料培养基。培养至第4d时，收集细胞。(2)常规细胞培养瓶：从250ml常规细胞培养瓶接种至5l常规细胞培养瓶，接种密度为0.6×10⁶cells/ml，2g/l载体介质(ge公司生产的cytodex-1)，37℃，5％co2培养。每隔1d利用人工补加补料培养基。培养至第4d时，收集细胞。

cho细胞的培养条件：(1)高效细胞培养瓶：从250ml高效细胞培养瓶34接种至5l高效细胞培养瓶32，接种密度为0.8×10⁶cells/ml，37℃，5％co2培养。当葡萄糖耗尽时，补料泵26补加补料培养基和葡萄糖。培养至第5d时，培养温度调至32℃。培养至第14d时，收集细胞。(2)常规细胞培养瓶：从250ml常规细胞培养瓶接种至5l常规细胞培养瓶，接种密度为0.8×10⁶cells/ml，37℃，5％co2培养。当葡萄糖耗尽时，人工补加补料培养基和葡萄糖。培养至第5d时，培养温度调至32℃。培养至第14d时，收集细胞。

取样和接种转移时，计算单次取样耗时和单次接种耗时；培养结束时，取样测定最终的平均细胞数和观察染菌状况结果并计算染菌率。

样品1000rpm离心15min，弃掉上清液，加入0.1％结晶紫染液，37℃水浴1h，采用血球计数板测定样品中细胞数。并观察细胞染菌状况，染菌率的计算公式为：染菌率(％)＝染菌瓶数/(未染菌瓶数+染菌瓶数)。

表1高效细胞培养瓶与常规细胞培养瓶的培养性能与可操作性比价

高效培养瓶培养的pk-15细胞和cho细胞的细胞密度比常规培养分别高达53.6％和37.8％。高效培养瓶不仅能保证细胞高密度生长，还能增加摇瓶的装液量，5l高效细胞培养瓶的装液系数可高达60％，而常规培养瓶的装液系数仅为30％。高效培养瓶和常规培养瓶分别采用离位取样和原位取样的方式，单次取样分别耗时6.9～7.6min和2.1～2.2min。高效培养瓶采用补料泵转移的方式接种，单次接种耗时仅为常规培养瓶接种时间的一半，且大大避免了染菌。

实施例2

考察hek-239细胞在高效细胞培养瓶中的放大性能。细胞的培养条件：从250ml高效细胞培养瓶34接种至5l高效细胞培养瓶32，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，37℃，5％co2培养。每隔1d补加补料培养基。培养至第7d时，收集细胞。每天取样测定细胞数和细胞活性。

细胞活性测定采用碘化丙啶(pi)染色的方法。藻细胞染色时，向样品中加入pi储备液(0.2μm滤膜过滤，于4℃下保存，最终浓度为10μmol/l，在黑暗室温条件下孵育20min。pi染料无法标记活细胞，而死亡细胞胞内pi染料被488nm激光激发后发射红荧光，被fl2通道(585nm)接收，fl2通道至少检测到10000个细胞。样品的分析流速为60μl/min，上样体积为10μl。

由图9可知，在250ml和5l高效培养瓶中hek-239细胞的细胞生长变化趋势相似，初期生长缓慢，然后进入快速生长期，在培养第6d时趋向稳定，培养第7d时细胞数达到4.6×10⁶cells/ml。该结果表明，hek-239细胞在250ml和5l高效培养瓶中获得基本一致的生长效果。

上述具体实施方式，仅为说明本发明的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。