EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程
技术领域：
，更具体地，涉及一种emp基因在水稻种子萌发发育中的应用。
背景技术：
：水稻种子的发芽过程可分为三个阶段：1．吸胀阶段：水稻种子胚乳中的淀粉、蛋白质等物质吸水膨胀，酶开始活动，呼吸作用加强，同时贮藏物质开始转化和运输。2．萌动阶段：随着稻种吸胀和含水量增加，种子代谢活动旺盛，胚乳养分被分解成简单的可溶性物质，同时胚吸收这些被分解的物质，形成新的复杂的有机物，构成新细胞，使细胞数目增多，体积增大。胚的体积增大到一定程度，突破种皮外露。3.发芽阶段：种子露白后，胚继续生长，当胚根伸长到与种子等长，胚芽伸长到种子长度的一半时，称为发芽。水稻种子的萌发特性如发芽能力、萌发速率与整齐度直接影响到种子播种质量、幼苗建成甚至最终的产量形成。不同水稻品种存在广泛的萌发特性的差异，其中，籼粳亚种间的差异比较明显，籼稻的萌发速率要快于粳稻。因此鉴定分析影响水稻种子萌发相关基因功能对于了解水稻种子萌发机理和降低农业生产中种子萌发率导致产量下降的风险有很大的意义，同时对培育水稻新品种也具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供emp基因在水稻种子萌发发育中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案给予实现的：本发明通过构建水稻os05g0349800序列所示基因的rna干涉载体并转化水稻中花11，获得反向遗传学突变体材料；将影响水稻种子萌发发育的rna干涉突变体材料与野生型水稻中花11种子分别诱导水稻种子萌发，并统计分析种子萌发发育能力显著差异，结果发现，os05g0349800序列所示基因为影响水稻种子萌发发育的基因；若水稻中该基因被破坏或不表达，即可导致水稻种子萌发再生能力下降。所述基因的序列如seqidno：1所示，其编码氨基酸序列如seqidno：2所示，所述蛋白为一个10.1kd小分子量蛋白；比对发现其为水稻emp基因，现有中仅公开了其与水稻渗透胁迫、盐胁迫和干旱胁迫的耐受性有关，除此之外的其他功能还未见报道。因此，本发明首先保护emp基因及其编码蛋白在如下几个方面的应用：seqidno：1所述的emp基因在水稻种子萌发发育中的应用。seqidno：2所述蛋白在水稻种子萌发发育中的应用。优选地，所述应用为提高或减缓水稻种子萌发发育水平。具体地，所述应用为构建过量表达seqidno：1所述基因的重组表达载体，并转化水稻植株；或构建seqidno：1所述基因的沉默载体，并转化水稻植株。优选地，所述沉默载体为rna干扰载体。优选地，所述rna干扰载体的两个dna片段的扩增引物依次如seqidno：3～6所示。seqidno：3ctagtcgactctagcctcgagatggcgtccgggcagcagseqidno：4atctgctccttcctcgtctseqidno：5ggaggcctggatcgactagtatggcgtccgggcagcagseqidno：6agacgaggaaggagcagatctcggcgaggttctcctg优选地，所述转化为农杆菌介导转化法。seqidno：1所述的emp基因在鉴别水稻种子萌发发育水平中的应用。具体地，所述应用为检测水稻品种中seqidno：1所示emp基因的表达水平，若emp基因表达水平高，则表示该水稻品种的种子萌发发育水平高，反之则表示该水稻品种的种子萌发发育水平低。优选地，所述emp基因的实时定量rt-pcr引物如seqidno：11和seqidno：12所示，内参基因osactin1的扩增引物如seqidno：9和seqidno：10所示，seqidno：9：5’-cacattccagcagatgtgga-3’seqidno：10：5’-accacaggtagcaataggta-3’seqidno：11：5’-tcatatggtgatgcgtgctt-3’seqidno：12：5’-aagaagctagcagctgctg-3。优选地，所述检测反应体系为：2×sybrgreen染料定量pcr反应液10μl，无菌水8.6µl，10µmol/l上下游引物各0.2µl，模板为1µl，总体积20μl。优选地，反应程序为（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环；（iii）72℃延伸5min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的emp基因与水稻种子萌发发育相关，通过检测emp基因的表达量，可以快速检测鉴定水稻品种种子萌发发育水平；同时，过表达emp基因，可提高水稻种子萌发发育水平，改良水稻种子萌发能力，培育新的水稻品种，也可减少或沉默水稻中emp基因的表达，从而减缓其种子萌发能力，适用于种子贮藏，具有较大的应用前景。附图说明图1为中花11和rna干涉突变体诱导种子萌发时期的基因表达水平的rt-pcr结果图；其中，zh是指野生型水稻中花11，empi是指雌激素诱导型rnai干涉转基因植株；+er指加入诱导剂雌激素er处理。图2为中花11和rna干涉突变体的种子萌发能力差异结果图；其中，zh是指野生型水稻中花11，empi是指雌激素诱导型rnai干涉转基因植株；+er指加入诱导剂雌激素er处理。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1水稻影响种子萌发能力相关基因emp的rna干涉突变体材料的获得根据ncbi数据库os05g0349800序列信息设计特异引物：seqidno：3：ctagtcgactctagcctcgagatggcgtccgggcagcagseqidno：4：atctgctccttcctcgtctseqidno：5：ggaggcctggatcgactagtatggcgtccgggcagcagseqidno：6：agacgaggaaggagcagatctcggcgaggttctcctg利用引物seqidno：3和seqidno：4组合以及seqidno：5和seqidno：6组合扩增两个dna片段后利用一步构建rna干涉载体方法（jiang,etal.,planta.2013.(238)：325-330）构建per8雌激素诱导型rna干涉载体（zuoj,etal.,2000.11(2):146-151.）。通过农杆菌介导转化方法转化中花11，获得稳定的转基因株系，该转基因株系的种子萌发能力与中花11相比显著下降，因此该转基因株系即影响种子萌发能力相关基因emp的rna干涉突变体材料。实施例2水稻影响种子萌发能力相关基因功能鉴定1、水稻rna的提取和反转录反应（1）取水稻（中花11）组织约0.5g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末后，放入2ml离心管中，加入1000μlrna提取缓冲液和200μl氯仿，混匀，65℃水浴5min；（2）在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心12min，去上清，用0.5ml70％的乙醇漂洗两次，风干，溶于20μldepc水中；（3）取1μlrna用于pcr反转录反应，反转录cdna第一链的合成（15μl），反应体系为：dnase处理后的总rna1μl、oligodt（10μmol/l）1μl、depc水补足15μl；该反应体系于65℃保温5min，冰上冷却3min，之后利用表1所述的体系，在42℃条件下反应1h，65℃加热10min终止反应，放入-20℃冰箱中备用。表15×第一链反应缓冲液5μldntps(10μmol/l)1μl反转录酶(200u/μl)1μlrna酶抑制剂1μldepcddh2o17μl总体积25μl2、pcr扩增和基因检测（一）具体操作如下：a.pcr反应体系包括无菌水16.2µl，10×buffer2µl，10µmol/l上下游引物（引物序列如seqidno：3和seqidno：4所示或者引物序列如seqidno：5和seqidno：6）各0.2µl，2.5mmol/ldntps0.2µl，5u/µltaqdna聚合酶0.2µl，50ng/µl模板dna1µl，反应体系的总体积为20μl。pcr的反应条件为：（i）94℃预变性5min，（ii）94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；（iii）72℃延伸5min。扩增得到的中花11的pcr产物长度分别为0.18kb和0.2kb；其核苷酸序列包含在seqidno：1所示序列内。参照ncbi网站上获得的水稻中花11的orf序列，设计特异性pcr引物，引物序列如seqidno：7和seqidno：8所示。seqidno：7：5’-atggcgtccgggcagcag-3’seqidno：8：5’-ctaggacttggtcttgtac-3’对提取的正常水稻中花11植株cdna进行扩增，其目的片段长度为288bp，并进行测序。将测序得到的dna序列即编码序列利用dnastar软件翻译成氨基酸序列如seqidno：2所示。（二）检测影响水稻种子萌发能力相关基因emp表达水平变化，具体操作如下：1、引物设计：seqidno：9：5’-cacattccagcagatgtgga-3’seqidno：10：5’-accacaggtagcaataggta-3’seqidno：11：5’-tcatatggtgatgcgtgctt-3’seqidno：12：5’-aagaagctagcagctgctg-3seqidno：9和seqidno：10引物为实时定量rt-pcr内参基因osactin1扩增引物，seqidno：11和seqidno：12引物为实时定量rt-pcr目标基因emp扩增引物。2、pcr反应体系：2×sybrgreen染料定量pcr反应液10μl，无菌水8.6µl，10µmol/l上下游引物各0.2µl，模板为1µl中花11或rna干涉突变体总rna的rt产物，反应体系的总体积为20μl。在realtimepcr仪上设定反应条件为：（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环；（iii）72℃延伸5min。经测序序列长度为0.2kb，其核苷酸序列包含在seqidno：1所示序列内。其实时定量pcr结果分析如图1所示：无论是否加入诱导剂雌激素，中花11种子在萌发培养基上随着培养时间的增加，emp表达水平迅速提高，与empi转基因材料的种子在不含诱导剂雌激素的萌发培养基上类似。而empi种子在含有诱导剂雌激素的萌发培养基上时，emp基因表达水平下降，说明在雌激素诱导emp基因的rna干涉结构的作用下，emp表达水平被下调。同时，本实施例按照上述方法提取了几个不同水稻品种的总rna，反转成cdna，然后用上述实时定量rt-pcr的反应引物、反应体系和程序进行emp基因表达水平的检测，于此同此，用传统的幼苗生长速率测定法在相同因素下对这几个水稻品种的种子进行萌发发育水平测试；结果显示，emp基因的表达量与种子萌发发育水平呈正相关，其反映出的种子萌发发育水平与传统测试结果一致；因此，可通过检测水稻emp基因的表达量来快速鉴定水稻品种的种子萌发发育水平。实施例3影响水稻种子萌发能力相关基因的功能验证采用雌激素诱导表达rna干涉产物并破坏水稻中seqidno：1的基因序列。经实时定量rt-pcr检测，其mrna表达水平下降，雌激素处理rnai干涉突变体种子萌发能力显著下降。影响水稻种子萌发能力相关基因的功能验证包括以下步骤：（1）利用雌激素诱导表达载体构建影响水稻种子萌发能力相关基因rna干涉载体，并通过农杆菌介导转化中花11并鉴定获得纯合转基因t2代材料。（2）将中花11和影响水稻种子萌发能力相关基因rna干涉转基因材料种子进行诱导愈伤，并转入正常萌发培养基和加入雌激素的萌发培养基培养。（3）统计萌发成功率与雌激素诱导表达rnai干涉造成的稻种子萌发能力相关基因表达下降的相关性，结果表明该基因表达水平下调影响了水稻中花11的种子萌发能力，如图2。实施例4过表达emp基因的转基因水稻植株通过选用常用的植物表达载体，构建emp基因的过表达载体，然后通过农杆菌介导转化中花11并鉴定获得纯合转基因t2代材料；将获得的转基因诱导愈伤，培育成新植株；结果显示，该转基因株系的种子萌发能力与中花11相比显著提高；同时提取该转基因水稻植株和中花11的rna，进行定量pcr检测，显示emp基因在转基因水稻植株中的表达量要显著高于中花11。sequencelisting<110>华南农业大学<120>emp基因在水稻种子萌发发育中的应用<130>2017<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>395<212>dna<213>emp基因<400>1atggcgtccgggcagcagcagcagggcaggtcggagctggaccgcatggccagggagggc60cagaccgtcgtccccggcggcaccggcggcaagagcctcgaggcccaggagaacctcgcc120gagggtatgcaaaataatactgaaacttttgatagatcaaacttgccatttcattcggta180tttcggttgaagtacgtaactaatatgcgtacgtgtgcatcgatcgatcagggcgcagcc240gcggggggcagacgaggaaggagcagatgggggaggaagggtaccgcgagatggggcgca300agggcggcctcagcaccggcgacgagtccggcggcgagcgcgccgcccgcgagggcatcg360acatcgacgagtccaagtacaagaccaagtcctag395<210>2<211>95<212>prt<213>emp蛋白<400>2metalaserglyglnglnglnglnglyargsergluleuaspargmet151015alaarggluglyglnthrvalvalproglyglythrglyglylysser202530leuglualaglngluasnleualagluglyargserargglyglygln354045thrarglysgluglnmetglyglugluglytyrargglumetglyarg505560lysglyglyleuserthrglyaspgluserglyglygluargalaala65707580arggluglyileaspileaspgluserlystyrlysthrlysser859095<210>3<211>39<212>dna<213>人工序列<400>3ctagtcgactctagcctcgagatggcgtccgggcagcag39<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4atctgctccttcctcgtct19<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列<400>5ggaggcctggatcgactagtatggcgtccgggcagcag38<210>6<211>37<212>dna<213>人工序列<400>6agacgaggaaggagcagatctcggcgaggttctcctg37<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7atggcgtccgggcagcag18<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8ctaggacttggtcttgtac19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9cacattccagcagatgtgga20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10accacaggtagcaataggta20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tcatatggtgatgcgtgctt20<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12aagaagctagcagctgctg19当前第1页12