马蔺半胱氨酸富集蛋白基因IlCDT1及其植物表达载体和构建方法与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1及其植物表达载体和构建方法。

背景技术：

重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染。我国耕地重金属污染的面积占耕地总量的1/6左右，其中镉（cd）污染概率为25.20%，远超过其他几种土壤重金属元素^[1]。镉是生物毒性最强的重金属元素之一，在水--土壤--植物系统中具有很强的迁移能力，严重影响农业生产、农产品安全与人体健康^[2]。土壤镉污染修复技术具体包括两大类，即物理化学修复和生物修复。植物修复是指利用植物去除污染土壤和废水中的重金属，并以其绿色净化、对环境无二次污染、投资低、方便应用等优势成为生物修复的热点^[3]。马蔺（irislacteavar.chinensis）系鸢尾科鸢尾属多年生草本植物，原产中国，分布于我国东北、华北、西北等20多个省区，具耐涝、耐旱、耐盐碱、耐践踏、抗病虫害等优良特性，是园林绿化、盐渍地改良、荒漠草原生态恢复的优异植被。同时，马蔺返青早、叶色青绿，花色淡雅美丽，是观叶赏花兼具的地被植物，具较强的镉吸收和富集能力。

cdt（cadmiumtolerance）是富含半胱氨酸（cys）的多肽蛋白，具有三个特点：①多肽长度小，一般由49-60个氨基酸组成；②拥有独特的基序，即在c端有7个保守和8个半保守的cys；③植物特有的蛋白。目前cdt参与植物耐镉调控在水稻和马唐中有报道^[4,5]，其调控的分子机制尚没有进一步阐述。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将半胱氨酸富集蛋白基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐重金属的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一个新的植物半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1，解决提高鸢尾属植物耐重金属性，修复土壤重金属污染的问题，

本发明还提供该植物半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1的植物表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制耐重金属新种质，可用于植物品种改良。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1，该基因的序列为seqidno.1。

马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1的植物表达载体，由所述的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1与植物表达载体构成。

所述的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1的植物表达载体优选先将经bamhi和noti双酶切的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1插入到入门载体pentry1a得到pentry1a-ilcdt1，然后经限制性内切酶pvui单酶切、lr重组酶重组获得植物表达载体pmdc43-ilcdt1。

所述的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

（1）设计引物ilcdt1-zf和ilcdt1-zr，以马蔺cdna为模板，用高保真酶进行pcr反应，扩增上游引物和下游引物分别引入bamhi和noti酶切位点，其中上游引物ilcdt1-zf序列为seqidno.2，下游引物ilcdt1-zr序列为seqidno.3；

（2）将步骤（1）的pcr产物连接到pmd19-tsimple载体，转化top10感受态细胞，提取阳性质粒pmd19-tsimple-ilcdt1；

（3）利用bamhi和noti对pmd19-tsimple-ilcdt1和植物入门载体pentry1a分别进行双酶切，连接经bamhi和noti双酶切pmd19-tsimple-ilcdt1得到的ilcdt1片段与bamhi和noti双酶切pentry1a得到的大片段，转化top10感受态细胞，阳性质粒即为马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1入门表达载体pentry1a-ilcdt1；

（4）利用限制性内切酶pvui对入门表达载体pentry1a-ilcdt1进行单酶切，获得pentry1a-ilcdt1线性片段，利用lr重组酶将pentry1a-ilcdt1线性化产物和pmdc43空载进行重组，获得植物表达载体pmdc43-ilcdt1。

所述的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1在提高植物的耐重金属性中的应用。

所述的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1的植物表达载体在提高植物的耐重金属性中的应用。

其中，所述的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1的植物表达载体优选将经bamhi和noti双酶切的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1经入门载体pentry1a-ilcdt1线性化后重组到物表达载体pmdc43得到的。

本发明的有益效果：

1．本发明提供的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1是一个新的耐重金属基因，该基因可提高植物耐重金属性。

2．本发明构建的马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐重金属新种质，提高植物的耐重金属性，可用于进行植物品种改良。

附图说明

图1植物表达载体pmdc43-ilcdt1构建方案图。

图2野生型与转基因拟南芥pcr和qrt-pcr鉴定结果，wt代表野生型拟南芥，35s::ilcdt1-1和35s::ilcdt1-2代表两个转基因拟南芥株系。

图3野生型与转基因拟南芥在镉胁迫下的根长表型和根长数据测定。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1ilcdt1的克隆

选用马蔺（irislacteavar.chinensis）作为材料，用100µmcdcl2处理马蔺幼苗，24小时后取其根，参照trizolrna提取试剂盒（takara）说明书方法，提取根总rna，按照m-mlv反转录试剂盒（takara）取1μg总rna反转录成cdna。

以提取的叶片cdna为模板，设计引物ilcdt1-f和ilcdt1-r进行pcr反应：

上游引物ilcdt1-f:atgtatccaccaccatcagca（seqidno.4）

下游引物ilcdt1-r:gagcagatttgaatgcctaa（seqidno.5）

50μl反应体系：10×rcrbuffer5.0μl，ilcdt1-f、ilcdt1-r引物各1.0μl（20μmol·l^-1），dntpmix4.0μl(2.5mmol·l^-1)，taqdnapolymerase0.2μl，cdna模板1μl，ddh2o37.8μl；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，反应32个循环，72℃延伸7min；pcr结束后进行琼脂糖电泳，产物用凝胶回收试剂盒（takara）回收纯化，用t4dna连接酶（takara）连接到pmd19-tsimple载体（takara），转化top10感受态细胞，序列测定为seqidno.1。

实施例2.植物表达载体pmdc43-ilcdt1的构建

设计引物ilcdt1-zf、ilcdt1-zr进行pcr反应，在目的基因ilcdt1的上游和下游分别引入酶切位点bamhi和noti，pcr产物连接到pmd19-tsimple载体，转化top10感受态细胞，提取阳性质粒，bamhi和noti双酶切的ilcdt1片段与bamhi和noti双酶切的pentry1a连接，转化，提取阳性质粒pentry1a-ilcdt1，在经pentry1a-ilcdt1线性化后重组到物表达载体pmdc43上，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为seqidno.1，具体步骤如下：

上游引物ilcdt1-zf:cgcggatccggatgtatccaccaccatca（seqidno.2）

下游引物ilcdt1-zr:ttgcggccgcgatacagcagcagcatag（seqidno.3）

（1）以马蔺根cdna作为模板，用高保真酶（primestar^tmhsdnapolymerase，takara）进行pcr反应，50μl反应体系：10×hsrcrbuffer5.0μl，nnpcs1-zf、nnpcs1-zr引物各1.0μl(20μmol·l^-1)，dntpmix4.0μl(2.5mmol·l^-1)，primestar^tmhsdnapolymerase0.4μl，cdna模板1μl，ddh2o37.6μl；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，反应32个循环，72℃延伸7min；pcr产物用凝胶回收试剂盒（takara）回收，连接到pmd19-tsimple载体，转化top10感受态细胞，pcr鉴定并提取阳性质粒pmd19-tsimple-ilcdt1；

（2）取入门载体pentry1a和pmd19-tsimple-ilcdt1分别用bamhi和noti双酶切，双酶切体系（50µl）：10×buffer2.5µl，质粒pentry1a或pmd19-tsimple-ilcdt110µl，bamhi2µl，noti2µl，ddh2o33.5µl；37℃反应3h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒（takara）回收质粒pentry1a大片段和pmd19-tsimple-ilcdt1小片段。用t4dna连接酶（takara）连接两个回收的产物，连接反应体系（10µl）：10×t4ligasebuffer1µl，pentry1a大片段2µl，pmd19-tsimple-ilcdt1小片段6µl，t4dna连接酶1µl；16℃过夜连接反应，取5µl连接产物转化top10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pentry1a-ilcdt1；

（3）将pentry1a-ilcdt1质粒用限制性内切酶pvui单酶切，单酶切体系（20µl）：10×fastdigest2µl；pvui1µl；质粒pentry1a-ilcdt15µl；ddh2o12µl；37°c酶切2h，80°c保温20min；将产物进行电泳检测，胶回收纯化，获得线性片段pentry1a-ilcdt1。将线性化片段与lr进行重组，重组体系（5µl）：pentry1a-ilcdt1线性化片段3µl；pmdc43空载体1µl；lr重组酶1µl；25°c连接4h，完成重组；取5µl连接产物转化top10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pmdc43-ilcdt1，测序验证为seqidno.1。植物表达载体pmdc43-ilcdt1的构建成功，质粒谱图及构建方案图见图1。

实施例3植物表达载体pmdc43-ilcdt1遗传转化拟南芥及其抗重金属性鉴定

（1）农杆菌菌株eha105感受态制备及冻融法转化

从yeb（50ug/ml利福平）平板上挑取eha105单菌落，接种于50ml含50ug/ml利福平的yeb液体培养基中，200rpm，28℃培养至od值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2ml预冷的100mmcacl2（20%甘油）溶液中，200ul/管分装，待用。取10ulpmdc43-ilcdt1载体质粒，加入200uleha105感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800ulyeb液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于yeb（50ug/ml利福平+50ug/ml卡那霉素）固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆pcr检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化；

（2）拟南芥花序浸染及种子筛选

将阳性单克隆接到50ml的yeb（50ug/ml利福平+50ug/ml卡那霉素）液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2ms，添加50克/升的蔗糖，调ph为5.8，然后加200ul/l的silwetl-77混合）剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收；

种子消毒与播种：将种子放入1.5ml的离心管中，加入1ml75%酒精，添加0.1%的tritonx-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95%的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子（放置30分钟），轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基（ms+20mg/l潮霉素+25mg/l氨苄青霉素）筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿；

（3）pcr鉴定及抗重金属性鉴定

待抗性苗7～8片叶，提取拟南芥叶片dna，pcr（引物ilcdt1-f和ilcdt1-r）鉴定，结果见图2。经pcr鉴定的t1代转基因苗继续生长，采收t2代种子。对野生型和t2代抗性转基因拟南芥进行qrt-pcr鉴定，结果见图2；

选取经qrt-pcr鉴定目的基因相对表达量最高的两株拟南芥进行重金属处理：将低温春化过的wt和转基因株系分别播到1/2ms培养基上，垂直生长一周，然后在超净工作台进行移苗，分别转移到1/2ms、1/2ms+100μmcd和1/2ms+200μmcd的培养基上，每个浓度培养基设置3个重复，置于短日照培养箱垂直培养2周，进行根长测定，发现镉胁迫下，转基因拟南芥较野生型根系生长更好（图3）。

综上所述，本发明构建了含有马蔺半胱氨酸富集蛋白基因的植物表达载体pmdc43-ilcdt1，其中ilcdt1首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的抗重金属cd的能力。

参考文献：

[1]宋伟，陈百明，刘琳.中国耕地土壤重金属污染概况[j].水土保持研究2013,20(2):293-298.

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[3]clemenss,aartsmgm,thomines,verbruggenn.plantscience:thekeytopreventingslowcadmiumpoisoning.trendsinplantscience2013,18(2):92-99.

[4]kuramatam,masuyas,takahashiy,kitagawae,inouec,ishikawas,youssefians,kusanot.novelcysteine-richpeptidesfromdigitariaciliarisandoryzasativaenhancetolerancetocadmiumbylimitingitscellularaccumulation.plantandcellphysiology2009,50(1):106-117.

[5]matsudat,kuramatam,takahashiy,kitagawae,youssefians,kusanot.anovelplantcysteine-richpeptidefamilyconferringcadmiumtolerancetoyeastandplants.plantsignaling&behavior2009,4(5):419-421.

序列表

<110>江苏省中国科学院植物研究所

<120>马蔺半胱氨酸富集蛋白基因ilcdt1及其植物表达载体和构建方法

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>162

<212>dna

<213>鸢尾属马蔺（irislacteavar.chinensis）

<400>1

atgtatccaccaccatcagcacaggagatgtcctactacgatcatgtgcagaagaggaag60

gaggagaagggttgcctctatgcttgcttgtttgcagcctgttgctgcttctgctgcgtc120

gagacttgtgagtgctgcctggatatgctatgctgctgctgt162

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgcggatccggatgtatccaccaccatca29

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgagctcagagactgaaggtgtgctgaggcca32

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtatccaccaccatcagca21

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gagcagatttgaatgcctaa20