本发明属生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对自噬相关基因beclin1编码区174-194位点的sirna序列的设计、筛选及其在调控人类细胞自噬水平中的应用。
背景技术：
自噬(autophagy)是一种程序化的细胞内降解过程，细胞通过包裹降解物形成自噬体运送至溶酶体进行消化，从而满足代谢需要、细胞器更新及维持细胞稳态。根据降解物与溶酶体结合途径的不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三类。其中，对巨自噬的研究最为深入，在此过程中很多自噬相关基因(autophagyrelatedgene,atg)编码的蛋白定位到自噬前体结构，即双层扁平杯状分隔膜形成的自噬泡。自噬泡伸展变形吞食包裹细胞内老化或损伤的细胞器/蛋白质，形成闭合的双层膜结构，称为自噬体。在细胞骨架驱动下，自噬体的外膜与溶酶体膜融合，内膜及包裹物质进入溶酶体，溶酶体脱颗粒并释放蛋白水解酶降解自噬体，部分降解产物可被细胞再利用。
自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，贯穿于正常细胞的生长发育和生理病理过程。自噬不仅能清除细胞内老化或损伤的细胞器和蛋白质，在维持蛋白质代谢平衡和细胞内环境稳定中起重要作用，而且也与病理性损伤的保护过程相关，对神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物感染等疾病的预防有积极作用。自噬具有高度的进化保守性，其发生、发展受多种atg基因的调控，至今已鉴定出30多种自噬特异性基因和50多种相关基因。
beclin1基因是酵母自噬基因atg6在哺乳类动物中的同源基因，是第一个被发现参与自噬过程的基因。其编码的beclin1蛋白由450个氨基酸组成，包含bh3、卷曲螺旋结构域和进化保守结构域等主要结构域。beclin1蛋白可调控自噬前体的形成，引导自噬相关蛋白定位于自噬体膜，是整个自噬过程中必不可少的关键分子。beclin1及其上下游信号调节蛋白组成了重要的自噬调节通路，通常以beclin1/pi3k3c复合体的形式与各种蛋白相互作用，从而达到调节自噬的目的。近年研究发现beclin1通过对自噬的调节，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用，是一个重要的抑癌基因。
rna干扰(rnainterference,rnai)是序列特异的双链rna使细胞内同源mrna降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。rnai的作用主要由长约21～23nt的小干扰rna(sirna)介导，由于rnai是sirna靶向作用mrna引起的特异性降解，因此要产生有效rnai的关键是选择合适的sirna作用靶点。rnai靶点的选择原则主要包括：①从靶基因起始密码子下游50～100nt开始查找；②选择以aa或na(n代表任意碱基)开始的序列；③选择gc含量在30％-60％左右的mrna区域；④避免连续的单一碱基和反向重复序列；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备sirna的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsrna经rnaseⅲ降解法、sirna表达载体转录法及pcr制备的sirna表达框法等5种。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种针对自噬相关基因beclin1编码区174-194位点的sirna的cdna序列，其核苷酸序列是：5’-ggaggaagagactaactcagg-3’。
本发明的另一个目的是提供该cdna序列在人类细胞自噬水平调控中的应用。
本发明根据sirna设计原则，选择的sirna的cdna序列gc含量为52.4％，对应beclin1基因编码区的第174-194位核苷酸。构建针对该sirna的真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染ad293细胞，能有效抑制beclin1基因的mrna水平和蛋白水平，因此可应用于人类细胞自噬水平的调控。
本发明的有益之处是：提供的sirna序列针对自噬相关基因beclin1的编码区，以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能持续、有效抑制beclin1基因的mrna水平和蛋白水平，故可作为人源细胞自噬水平调控的一个有效靶点。
具体实施方式
本发明通过实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
实施例1sirna真核表达载体体外抑制beclin1-egfp融合蛋白的表达
1.sirna的设计：根据sirna设计原则，从beclin1基因编码区起始密码子atg下游50nt处搜索na序列，其3’端相邻21nt序列作为候选靶点，从中选择gc含量在30～60％的sirna序列，并通过genbank数据库的blast功能与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。最终选择的sirna其cdna序列为5’-ggaggaagagactaactcagg-3’，gc含量为52.4％，对应beclin1基因编码区的第174-194位核苷酸。
2.表达sirna所需shdna的合成与制备：表达sirna所需shdna的正义链序列为5’-gatccggaggaagagactaactcaggttcgcctgagttagtctcttcctccttttta-3’，反义链序列为5’-agcttaaaaaggaggaagagactaactcaggcgaacctgagttagtctcttcctccg-3’，委托生物公司合成，将正、反义链分别退火形成双链。
3.sirna真核表达载体的构建：具有u6启动子的真核表达质粒psilencer2.0-u6用bamhi和hindⅲ双酶切，与退火后的shdna双链连接，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，37℃培养过夜，挑取克隆抽提质粒送生物公司进行dna测序鉴定，选取测序结果正确的质粒扩增、保存。
4.sirna表达质粒体外抑制beclin1-egfp融合蛋白表达的实验
(1)融合蛋白质粒pbeclin1-egfp：为表达绿色荧光蛋白(egfp)和beclin1融合蛋白的质粒，由beclin1基因cdna插入pegfp-n1质粒的hindⅲ和ecori位点构建而成，由于egfp位于beclin1的下游，且共用一个启动子，故egfp的表达情况可间接反映beclin1的表达。
(2)sirna表达质粒与融合蛋白质粒共转染ad293细胞：人胚肾细胞ad293接种12孔细胞培养板后，待细胞达到80％～90％融合率，用invitrogen公司lipofectamine2000试剂将sirna表达质粒与融合蛋白质粒pbeclin1-egfp共转染细胞，操作方法参照试剂说明书，同时设转染空质粒psilencer2.0-u6的阴性对照组和不转染质粒的空白对照组，5小时后换培养液(含10％新生牛血清的dmem)继续培养。
(3)荧光定量rt-pcr检测ad293细胞中beclin1基因mrna的表达：质粒转染后48h，收集ad293细胞，trizol法抽提细胞总rna，采用takara公司的sybrprimescriptrt-rcpkit检测beclin1基因的mrna水平，实验方法参照试剂盒说明书。beclin1基因pcr引物序列为：上游5’-ctggggacctttttgacatc-3’，下游5’-ttgcggttcttttccacgtc-3’。内参照采用gapdh，pcr引物序列为：上游5’-gaaggtgaaggtcggagtc-3’，下游5’-gaagatggtgatgggatttc-3’。结果显示，与阴性对照组相比，sirna表达质粒对beclin1基因mrna表达的抑制率为81.7％。
(4)流式细胞仪检测ad293细胞中beclin1蛋白表达情况：质粒转染后72h，收集每孔内细胞，用pbs缓冲液洗涤2次后重悬于pbs中。用流式细胞仪在488nm激发波长下检测每孔细胞平均荧光强度(meanfluorescenceintensity,mfi)及荧光阳性细胞比率α，计算每孔细胞的总荧光强度(totalfluorescenceintensity,tfi)＝mfi×α。结果显示，与阴性对照组相比，sirna表达质粒对beclin1蛋白表达的抑制率为73.4％。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。
<110>浙江大学
<120>针对自噬相关基因beclin1编码区174-194位点的sirna序列及其应用
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<213>人工序列
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<223>根据自噬相关基因beclin1设计的sirna的cdna序列
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<213>人工序列
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<223>制备beclin1基因sirna所需shdna正义链的序列
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<223>制备beclin1基因sirna所需shdna反义链的序列
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<223>beclin1基因pcr扩增的上游引物序列
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<223>beclin1基因pcr扩增的下游引物序列
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<223>gapdh基因pcr扩增的上游引物序列
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<223>gapdh基因pcr扩增的下游引物序列
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